核(he)酸(suan)提(ti)取試劑盒(he)的(de)工作原(yuan)理(li)

核(he)酸(suan)提(ti)取試劑盒(he)的(de)工作原(yuan)理(li)

子(zi)生物(wu)學實(shi)驗中 qPCR、分(fen)子克(ke)隆(long)、下(xia)壹(yi)代測(ce)序等(deng)都需要(yao)進(jin)行DNA提(ti)取。 

  如今(jin)，大多(duo)數(shu)實(shi)驗室(shi)都使用商業 DNA 提(ti)取試劑盒(he)，這(zhe)些試劑盒(he)使用矽膠(jiao)自(zi)旋過濾(lv)法來獲(huo)得(de)高質(zhi)量的 DNA。這些可(ke)以(yi)快(kuai)速(su)有效地(di)純化(hua) DNA（或(huo) RNA），在這(zhe)裏(li)需要(yao)先(xian)了(le)解壹(yi)下(xia)DNA 提(ti)取試劑盒(he)的(de)工作原(yuan)理(li)。

核(he)酸(suan)提(ti)取試劑盒(he)的(de)工作原(yuan)理(li)

離(li)心柱(zhu)包含壹(yi)種(zhong)矽膠(jiao)樹(shu)脂，可根(gen)據(ju)鹽條(tiao)件和(he)受提(ti)取方法(fa)影響的其他(ta)因素(su)選擇性地(di)結(jie)合(he) DNA 和(he) RNA。這些 DNA 提(ti)取試劑盒(he)使整(zheng)個(ge)過程比(bi)舊(jiu)的 DNA 分(fen)離(li)方(fang)法更(geng)容(rong)易、更(geng)快(kuai)。但(dan)是(shi)，使用套件(jian)的缺點是(shi)，如果(guo)您(nin)不了(le)解套(tao)件的(de)黑匣(xia)子中的內容，則(ze)會(hui)使故(gu)障排(pai)除變(bian)得更(geng)加(jia)困(kun)難。

RNA和(he)DNA提(ti)取

裂解：裂解公(gong)式(shi)可(ke)能(neng)因您(nin)要提(ti)取 DNA 還是(shi) RNA 而異(yi)，但(dan)共(gong)同(tong)點是(shi)含有(you)高濃(nong)度離(li)液(ye)鹽的裂解緩(huan)沖(chong)液。
Chaotropes（離(li)液(ye)劑）的作用：Chaotrope會(hui)破(po)壞氫(qing)鍵(jian)及(ji)疏(shu)水間(jian)的相互作用。離(li)液(ye)鹽包括鹽(yan)酸(suan)胍、硫氰(qing)酸(suan)胍、尿(niao)素(su)和(he)高(gao)氯酸(suan)鋰(li)。
洗滌(di)劑：除了(le)離(li)液(ye)劑外，裂解緩(huan)沖(chong)液中通(tong)常還(hai)有(you)壹些(xie)去汙劑，以(yi)幫助蛋白(bai)質溶解和(he)裂解。
溶菌酶(mei)和(he)蛋白(bai)酶(mei)K:根(gen)據(ju)樣品類型，也可(ke)以(yi)使用酶(mei)進(jin)行(xing)裂解。蛋白(bai)酶(mei) K 就是(shi)其中之(zhi)壹，實(shi)際上在這些變(bian)性(xing)緩(huan)沖(chong)液中效果較好(hao)；當蛋白(bai)質變(bian)性增多，蛋白(bai)酶(mei) K 的(de)作用也會(hui)相應(ying)增強(qiang)。然而，溶菌酶(mei)在(zai)變(bian)性中不起(qi)作用，因此(ci)溶菌酶(mei)處(chu)理(li)通(tong)常在(zai)添(tian)加(jia)變性鹽之(zhi)前進(jin)行。

關於質粒制(zhi)備的(de)註意事項(xiang)

分(fen)離(li)質(zhi)粒 DNA 與提(ti)取 RNA 或(huo)基(ji)因組(zu) DNA 的(de)提(ti)取方式(shi)是(shi)不相(xiang)同(tong)的(de)，因為(wei)必(bi)須質(zhi)粒與基(ji)因組(zu) DNA 必(bi)須分(fen)離(li)。如(ru)果此刻(ke)，您(nin)加入(ru)離(li)液(ye)劑將(jiang)立(li)即釋放(fang)所(suo)有(you)物(wu)質(zhi)，並(bing)且無(wu)法將(jiang)小環(huan)狀(zhuang) DNA 與高分(fen)子量染(ran)色體區別(bie)開(kai)來(lai)。因此(ci)，在(zai)質粒制(zhi)備過程中中，直到裂解後才(cai)加(jia)入(ru)離(li)液(ye)劑，鹽用於結(jie)合(he)。

DNA 提(ti)取後純(chun)化(hua)：將(jiang) DNA 與色譜柱(zhu)結(jie)合(he)

離(li)液(ye)鹽對於(yu)裂解至關(guan)重(zhong)要，而且對(dui)於將(jiang) DNA（或(huo) RNA）與色譜柱(zhu)結(jie)合(he)也(ye)是(shi)如此(ci)。此外，為了(le)增強(qiang)和影響核酸(suan)與二氧(yang)化(hua)矽(gui)的(de)結(jie)合(he)，還(hai)添(tian)加(jia)了(le)酒(jiu)精。
大多(duo)數(shu)情(qing)況(kuang)下(xia)這(zhe)是(shi)乙醇，但有時(shi)可(ke)能(neng)是(shi)異(yi)丙(bing)醇。乙醇百分(fen)比(bi)和(he)體積(ji)有(you)很(hen)大的(de)影響。太多(duo)，妳(ni)會(hui)帶入大量(liang)降解的核(he)酸(suan)和小物(wu)種(zhong)，這(zhe)會(hui)影響 A260 讀(du)數(shu)並(bing)降低妳(ni)的壹些產量。太(tai)少，可(ke)能(neng)難以(yi)從膜上洗(xi)掉(diao)所(suo)有鹽分(fen)。
如果您(nin)在裂解中使用含有(you) SDS 的去汙劑，請嘗試(shi)使用NaCl 作為沈(chen)澱(dian)劑，以(yi)避免去汙劑汙染(ran) DNA 或(huo) RNA。

洗滌(di) DNA（或(huo) RNA）

當裂解物(wu)通(tong)過矽(gui)膠(jiao)膜進(jin)行(xing)離(li)心分(fen)離(li)，現(xian)在所(suo)提(ti)取的 DNA 或(huo) RNA 應(ying)該與柱子結(jie)合(he)，雜(za)質、細胞蛋白(bai)和多(duo)糖(tang)應(ying)該已經通(tong)過了(le)。 
但是(shi)，膜仍(reng)然被殘(can)留(liu)的細胞蛋白(bai)質和(he)鹽弄臟。如(ru)果(guo)樣品來自(zi)植物(wu)，仍(reng)然會(hui)有多(duo)糖(tang)，也(ye)許壹(yi)些(xie)色素留(liu)在膜上，或(huo)者如(ru)果樣品是(shi)血液(ye)，膜可(ke)能(neng)會(hui)被染(ran)成棕色或(huo)黃(huang)色。

通(tong)過洗(xi)滌(di)的(de)方法去除雜(za)質

通(tong)常有(you)兩(liang)次(ci)洗滌(di)，盡(jin)管(guan)這可(ke)能(neng)因樣品類型而異(yi)。初(chu)次(ci)洗滌(di)通(tong)常會(hui)含有(you)少量(liang)的(de)離(li)液(ye)鹽，以(yi)去除蛋白(bai)質和(he)有色汙染(ran)物(wu)。 這(zhe)之(zhi)後總(zong)是(shi)用乙醇洗滌(di)以(yi)除去鹽。
如(ru)果開(kai)始的準備工作沒(mei)有(you)大量(liang)蛋白(bai)質，例(li)如質粒準備或(huo) PCR 清理(li)，則(ze)只需要(yao)乙醇洗滌(di)。去除離(li)液(ye)鹽對於(yu)獲(huo)得(de)高產(chan)量和高純度(du)的 DNA 或(huo) RNA 至關(guan)重(zhong)要。壹(yi)些試劑盒(he)甚(shen)至會(hui)用乙醇清洗(xi)柱(zhu)子兩次(ci)。
如果(guo)殘留(liu)鹽分(fen)，核酸(suan)的洗脫(tuo)會(hui)很(hen)差，A230讀(du)數(shu)會(hui)很(hen)高，導(dao)致(zhi)260/230的(de)比(bi)率(lv)很(hen)低。對(dui)於(yu)無(wu)乙醇 DNA 和 RNA，需要(yao)進(jin)行幹(gan)法離(li)心，乙醇洗滌(di)後(hou)，大多(duo)數(shu)方(fang)案都有(you)壹(yi)個(ge)離(li)心步(bu)驟(zhou)來(lai)幹(gan)燥柱子。這(zhe)是(shi)為了(le)去除乙醇，對於清潔的洗脫(tuo)液(ye)是(shi)必要(yao)的。 
當(dang)將(jiang) 10 mM Tris 緩(huan)沖(chong)液或(huo)水應(ying)用於膜(mo)進行(xing)洗(xi)脫(tuo)時(shi)，核(he)酸(suan)會(hui)水合(he)並從(cong)膜(mo)中釋放(fang)出(chu)來。如(ru)果色譜柱(zhu)上仍(reng)有乙醇，則核酸(suan)無法再(zai)與(yu)水融(rong)合。如(ru)果跳過幹(gan)燥步(bu)驟(zhou)會(hui)導(dao)致(zhi)乙醇汙染(ran)和(he)低(di)產(chan)量(liang)。很(hen)可能(neng)在 Nanodrop 上(shang)看不(bu)到乙醇吸光度，所(suo)以(yi)它不會(hui)出(chu)現(xian)在您(nin)的讀(du)數(shu)中。

RNA 和 DNA 提(ti)取：洗脫(tuo)法(fa)

DNA 提(ti)取方案(an)的(de)還剩(sheng)余(yu)IDE步(bu)驟(zhou)步(bu)就是(shi)從矽(gui)膠(jiao)中釋放(fang)純(chun) DNA 或(huo) RNA。
  對於(yu) DNA 制(zhi)備，通(tong)常使用 pH 值為(wei) 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在(zai)弱(ruo)堿(jian)性(xing) pH 值下(xia)更(geng)穩定(ding)，在(zai)緩(huan)沖(chong)液中溶解得(de)更(geng)快(kuai)。即(ji)使對(dui)於(yu) DNA 顆粒也是(shi)如此(ci)。水的(de) pH 值往往較(jiao)低(di)，低至 4-5，並(bing)且高(gao)分(fen)子量 DNA 在(zai)用於洗(xi)脫(tuo)的(de)短(duan)時(shi)間(jian)內可能(neng)無法(fa)再(zai)與(yu)水結(jie)合(he)。
通(tong)過在(zai)離(li)心前(qian)讓(rang)緩(huan)沖(chong)液在(zai)膜中停(ting)留(liu)幾分(fen)鐘，可以(yi)較大限(xian)度(du)地(di)洗脫(tuo) DNA。
由(you)於(yu)RNA 易溶於水(shui)，且RNA 利(li)於處(chu)在(zai)微(wei)酸(suan)性的 pH 值環境下(xia)。
  蘇(su)州阿爾(er)法生物(wu)提(ti)供(gong)PCR儀、均質(zhi)儀、質粒取試劑盒(he)、DNA提(ti)取試劑盒(he)、血(xue)液基(ji)因組(zu)提(ti)取試劑盒(he)、RNA提(ti)取試劑盒(he)等(deng)廣泛應(ying)用於分(fen)子生物(wu)學。