酶(mei)聯免(mian)疫(yi)吸(xi)附(fu)試驗(yan)類型

ELISA 在(zai)原理上(shang)類似於(yu)放射免(mian)疫(yi)測(ce)定(ding) (RIA)，但更(geng)安(an)全且成本較(jiao)低(di)。
ELISA 有助於(yu)抗原或(huo)抗(kang)體的(de)定(ding)性（存(cun)在(zai)或(huo)不(bu)存(cun)在(zai)）和定(ding)量（濃(nong)度）測(ce)量。
當前(qian)使用的酶(mei)聯免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)技(ji)術(shu)主(zhu)要(yao)有以(yi)下幾(ji)種(zhong)：
1.直(zhi)接(jie)ELISA
直接(jie)和間(jian)接 ELISA 都(dou)從將抗(kang)原包被到 ELISA 板上開始。
步驟：

•   將抗原添加到板中(zhong)，在(zai) 37 攝(she)氏度下孵(fu)育壹小(xiao)時或(huo)在(zai) 4 攝(she)氏度下孵(fu)育過(guo)夜(ye)。

•   孵(fu)育步驟完成後(hou)，下壹步是(shi)清洗(xi)任何潛(qian)在(zai)未(wei)結(jie)合抗體的(de)板，並(bing)使用 BSA、卵清(qing)蛋(dan)白(bai)、抑肽酶(mei)或(huo)其(qi)他動(dong)物蛋(dan)白(bai)等試劑封(feng)閉 ELISA 板上任何未(wei)結(jie)合的位點(dian)。

•   這壹步很重要(yao)，因為它(ta)可以(yi)防(fang)止(zhi)任(ren)何非(fei)特(te)異性抗(kang)體(ti)與板結(jie)合，並(bing)盡(jin)可(ke)能地減少假陽(yang)性結(jie)果(guo)。添(tian)加緩沖液後(hou)，重新(xin)洗滌(di)板，並(bing)添加選(xuan)定(ding)的 酶(mei)聯檢(jian)測壹抗(kang) 。將板進壹步溫(wen)育壹小(xiao)時。

•   在(zai)直接(jie) ELISA 中(zhong)，主要(yao)檢(jian)測抗(kang)體直接(jie)與感(gan)興(xing)趣(qu)的(de)蛋(dan)白(bai)質結(jie)合。

•   接下來(lai)，重新(xin)洗滌(di)板以(yi)去除(chu)任何未(wei)結(jie)合的抗體(ti)，然後(hou)向板中(zhong)添加底物/發(fa)色(se)團(tuan)，例如堿性磷酸酶(mei) (AP) 或(huo)辣(la)根過(guo)氧(yang)化(hua)物酶(mei) (HRP)，從而(er)導(dao)致顏(yan)色(se)變化(hua)。樣品的顏(yan)色(se)變化(hua)是(shi)通(tong)過(guo) AP 從底物中(zhong)水(shui)解(jie)磷酸基(ji)團(tuan)或(huo)通(tong)過(guo) HRP 氧(yang)化(hua)底物而(er)發生(sheng)的。

  使(shi)用直接(jie) ELISA 的(de)優勢主(zhu)要(yao)是(shi)消(xiao)除(chu)二抗(kang)交叉反應(ying)，並(bing)且由於(yu)步驟更少，與間(jian)接 ELISA 相比速(su)度(du)更快(kuai)。它(ta)的缺(que)點(dian)包括與其(qi)他(ta)類型的 ELISA 相比靈(ling)敏(min)度低(di)，反應(ying)成(cheng)本(ben)高。

2. 間(jian)接 ELISA
    間(jian)接 ELISA 的步驟與直(zhi)接(jie) ELISA 相同，除(chu)了(le)額外(wai)的(de)洗(xi)滌(di)步驟和去除(chu)緩沖(chong)液(ye)後(hou)添加的抗體類型。間(jian)接 ELISA 需(xu)要(yao)兩(liang)種抗(kang)體，壹種(zhong)是(shi)粘附在(zai)目的(de)蛋(dan)白(bai)上的(de)檢測壹抗(kang)，另壹種(zhong)是(shi)與壹抗(kang)互補的(de)酶(mei)聯二(er)抗。
    開始需(xu)要(yao)加入(ru)壹抗(kang)，然後(hou)進行洗滌(di)步驟，再加入(ru)酶(mei)聯二(er)抗並(bing)孵(fu)育。此(ci)後(hou)，步驟與直(zhi)接(jie) ELISA 相同，包(bao)括洗(xi)滌(di)步驟、添加底物和(he)檢(jian)測(ce)顏(yan)色(se)變化(hua)。
簡要(yao)步驟如下：

• 將(jiang)含(han)有壹抗(kang) (Ab1) 的樣品添加到抗原包被的(de)微(wei)量滴(di)定孔中(zhong)，然後(hou)附著在(zai)孔中(zhong)的抗(kang)原與 Ab1 發(fa)生(sheng)反應(ying)。

• 未(wei)結(jie)合或(huo)遊(you)離的(de) Ab1 都(dou)被洗(xi)掉(diao)，酶(mei)標二(er)級抗體 (Ab2) 被添(tian)加到微(wei)量滴(di)定孔中(zhong)。

• 與酶(mei)偶聯(lian)的二抗與壹抗(kang)結(jie)合。

• 遊離或(huo)未(wei)結(jie)合的 Ab2 都(dou)被洗(xi)掉(diao)，並(bing)添加酶(mei)的特(te)定(ding)底物。

• 形(xing)成(cheng)的(de)有色(se)反應(ying)產(chan)物的(de)量的(de)測定(ding)主要(yao)由(you)紫外(wai)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)、酶(mei)標儀、微(wei)孔板讀(du)板機等儀器(qi)來(lai)完成。

       間(jian)接 ELISA法(fa)也常用於(yu)檢測(ce)血清中(zhong)是(shi)否存(cun)在(zai)抗 HIV 抗(kang)體(ti)。與直(zhi)接(jie) ELISA 相比，間(jian)接 ELISA 具有較(jiao)高的靈(ling)敏(min)度，反應(ying)成(cheng)本(ben)較(jiao)低(di)，這(zhe)種(zhong)類型的 ELISA 的主要(yao)缺(que)點(dian)是(shi)二級(ji)檢測抗體之間(jian)存(cun)在(zai)交叉反應(ying)的(de)風(feng)險。 
3.  酶(mei)聯免(mian)疫(yi)吸(xi)附(fu)試驗(yan)-夾(jia)心(xin)式elisa
與直(zhi)接(jie)和間(jian)接 ELISA 不(bu)同(tong)，夾(jia)心(xin) ELISA 從包被到板孔上的捕獲(huo)抗(kang)體開(kai)始。因為抗(kang)原夾在(zai)兩層(ceng)抗(kang)體（捕獲(huo)抗體和檢(jian)測抗(kang)體(ti)）之間(jian)，所(suo)以(yi)也稱(cheng)為“三(san)明治(zhi)"。
   流(liu)程(cheng)如下：將(jiang)捕(bu)獲抗(kang)體(ti)添(tian)加到板中(zhong)後(hou)，將板蓋上並(bing)在(zai) 4°C 下孵(fu)育過(guo)夜(ye)。包被步驟完成後(hou)，用 PBS 清洗(xi)板，然後(hou)用 BSA緩沖(chong)/封(feng)閉。緩沖(chong)液洗滌(di)在(zai)室溫(wen)下進(jin)行至少 1-2 小時。末了(le)，在(zai)加入(ru)抗原之前(qian)用PBS再次(ci)洗(xi)滌(di)板。
   然後(hou)將目標抗原添加到板中(zhong)以(yi)與捕(bu)獲(huo)抗體(ti)結(jie)合並(bing)在(zai) 37 攝(she)氏度下孵(fu)育 90 分(fen)鐘(zhong)。重新(xin)清洗(xi)板，然後(hou)將檢測壹抗(kang)添加到板中(zhong)並(bing)再孵(fu)育 1 至 2 小時在(zai)室溫(wen)下，然後(hou)用緩沖(chong)液(ye)清洗。然後(hou)加入(ru)酶(mei)聯二(er)抗，再孵(fu)育 1 至 2 小時。重新(xin)清洗(xi)板，加入(ru)底物以(yi)產生(sheng)顏(yan)色(se)變化(hua)。夾心 ELISA 在(zai)所(suo)有 ELISA 類型中(zhong)具有具有較(jiao)高的靈(ling)敏(min)度。夾心式elisa 的主(zhu)要(yao)缺(que)點(dian)是(shi)會(hui)耗(hao)費(fei)較(jiao)多的(de)時間(jian)和費(fei)用，另外(wai)這(zhe)種(zhong)ELISA 方法(fa)，必(bi)須(xu)要(yao)使(shi)用配對(dui)的(de)抗原（二價/多價抗原）和二(er)抗。
簡(jian)略(lve)步驟如下：

• 使(shi)用夾心(xin)式(shi)elisa，抗體被固定在(zai)微(wei)量滴(di)定孔中(zhong)，而(er)不(bu)是(shi)抗原。

• 添加含有待檢測(ce)或(huo)測(ce)量的(de)抗原的樣品並(bing)使其與固定化抗體(ti)反應(ying)。

• 清(qing)洗(xi)孔並(bing)加入(ru)對抗(kang)原上不(bu)同(tong)表(biao)位具有特(te)異性的(de)第(di)二種(zhong)酶(mei)聯抗(kang)體，並(bing)使其與結(jie)合的抗原反應(ying)。

• 通(tong)過(guo)洗滌(di)去除(chu)任何遊(you)離的(de)二(er)抗後(hou)，加入(ru)酶(mei)特(te)異性底物。

• 這(zhe)稱(cheng)為夾(jia)心 ELISA，因為待檢測(ce)的(de)抗(kang)原夾在(zai)兩種(zhong)抗(kang)體（結(jie)合抗體和(he)酶(mei)聯抗(kang)體）之間(jian)。

• 末了(le)，通(tong)過(guo)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)、酶(mei)標儀等(deng)實(shi)驗(yan)室儀器(qi)使(shi)用分(fen)光(guang)光(guang)度(du)法(fa)來(lai)測定有色(se)反應(ying)產(chan)物。

4. 酶(mei)聯免(mian)疫(yi)吸(xi)附(fu)試驗(yan)-競(jing)爭(zheng)性 ELISA
  競(jing)爭(zheng)性 ELISA方法(fa)主要(yao)用於(yu)檢測(ce)血清中(zhong)是(shi)否具有特(te)異性的(de)抗(kang)原/抗體(ti)。這種(zhong)類型的 ELISA 會(hui)使(shi)用兩種(zhong)特(te)異性抗(kang)體(ti)，壹種(zhong)酶(mei)聯抗(kang)體和另壹種(zhong)存(cun)在(zai)於(yu)測試血清中(zhong)的抗(kang)體（如果(guo)血清呈陽(yang)性）。將(jiang)兩(liang)種(zhong)抗體(ti)結(jie)合到孔中(zhong)將允許競爭(zheng)結(jie)合抗原。顏(yan)色(se)變化(hua)的存(cun)在(zai)意(yi)味著(zhe)測試是(shi)陰(yin)性的(de)，因為酶(mei)結(jie)合抗體結(jie)合了(le)抗(kang)原（而(er)不(bu)是(shi)測試血清的(de)抗(kang)體(ti)）。沒(mei)有顏(yan)色(se)表(biao)明(ming)測試呈陽(yang)性，並(bing)且測試血清中(zhong)存(cun)在(zai)抗體(ti)。
     該(gai)技術中(zhong)，需(xu)要(yao)將(jiang)抗體(ti)與溶(rong)液(ye)形式(shi)的抗原（在(zai)樣品中(zhong)）壹起(qi)孵(fu)育，然後(hou)將該混(hun)合物添(tian)加到抗原包被的(de)微(wei)量滴(di)定孔中(zhong)。樣品中(zhong)存(cun)在(zai)的抗(kang)原越多(duo)，可用於(yu)結(jie)合抗原包被孔的遊離抗(kang)體(ti)就(jiu)越少。添加對壹抗(kang)同種型具有特(te)異性的(de)酶(mei)偶聯(lian)二抗 (Ab2) ，用於(yu)確(que)定(ding)與孔結(jie)合的壹抗(kang)數(shu)量，如在(zai)間(jian)接 ELISA 中(zhong)壹樣。
    競爭(zheng)性 ELISA 特(te)異性低(di)，不(bu)能(neng)用於(yu)稀釋(shi)樣品。然而(er)，好處是(shi)需(xu)要(yao)的(de)樣品純化(hua)較(jiao)少，它(ta)可以(yi)測量給定樣品中(zhong)的大(da)範(fan)圍(wei)抗(kang)原，可用於(yu)小抗(kang)原。然而(er)，需(xu)要(yao)註意(yi)的是(shi)在(zai)該技(ji)術(shu)中(zhong)，原始樣品中(zhong)抗原的濃(nong)度越高，吸光(guang)度(du)越低(di)。 

 酶(mei)聯免(mian)疫(yi)吸(xi)附(fu)試驗(yan) ELISA的(de)應(ying)用：
1.檢測(ce)和(he)測量給定樣品中(zhong)的抗(kang)原或(huo)抗(kang)體。（自(zi)身(shen)抗體(ti)：抗 dsDNA、抗 dsg1、ANA 等；傳(chuan)染(ran)病抗體(ti)：抗菌(jun)、抗(kang)病毒(du)、抗真(zhen)菌(jun)；甲型、乙型、丙型肝(gan)炎(yan)、艾滋病毒(du)等）
2.檢測和(he)估(gu)計(ji)腫(zhong)瘤標誌物的(de)水(shui)平(ping)：比如：前(qian)列(lie)腺(xian)特(te)異性抗(kang)原 (PSA)、癌胚抗原 (CEA)

• 檢測(ce)食品樣品中(zhong)的潛(qian)在(zai)過(guo)敏(min)原。

• 用於(yu)某(mou)些類別藥(yao)物的(de)快(kuai)速(su)推(tui)定篩選(xuan)。

• 肽、抗(kang)體(ti)、激素(su)、蛋(dan)白(bai)質等物質的檢測和(he)定(ding)量

• 外(wai)泌體檢(jian)測(ce)、細(xi)胞外(wai)囊泡(pao)檢測(ce)等

 影響酶(mei)聯免(mian)疫(yi)吸(xi)附(fu)試驗(yan)ELISA結(jie)果(guo)的(de)因素有哪(na)些？
主(zhu)要(yao)包(bao)括檢(jian)測(ce)板、包被緩(huan)沖(chong)液(ye)、捕獲抗(kang)體(ti)、封(feng)閉緩沖(chong)液、靶抗原、檢測(ce)抗體(ti)、酶(mei)偶聯(lian)物、洗(xi)滌(di)液、底物、信(xin)號(hao)檢測(ce)的質量和(he)完整性都(dou)會(hui)幹(gan)擾(rao)正確(que)的(de) ELISA 測(ce)試。壹些(xie)可能幹(gan)擾(rao)測試的因素如下：
1.微(wei)孔板：孔的形狀和質量、板的材料、潛(qian)在(zai)的預(yu)激(ji)活、均勻(yun)或(huo)不(bu)均(jun)勻(yun)的(de)塗層
2.緩沖液(ye)：pH、汙染(ran)
3.捕獲和(he)檢測抗體(ti)：孵(fu)育時間(jian)、溫(wen)度、特(te)異性、滴(di)度、親(qin)和(he)力(li)
4.封(feng)閉緩沖(chong)液：交叉反應(ying)、濃(nong)度(du)、汙染(ran)
5.靶抗原：構(gou)象、穩(wen)定(ding)性、表(biao)位
6.酶(mei)結(jie)合物：類型、濃度、功能、交叉反應(ying)
7.清(qing)洗(xi)：汙染(ran)、頻(pin)率(lv)、體(ti)積(ji)、持續時間(jian)、成分(fen)
8.基(ji)板：微(wei)孔板的質量、材(cai)質
9.檢測：檢測(ce)相關(guan)的儀器(qi)設備：比如：分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)、讀(du)板機等相關(guan)因素
10. 誤(wu)差(cha)：人為誤(wu)差(cha)（實(shi)驗(yan)步驟不(bu)規範等(deng)）
     蘇州阿爾法(fa)生物提(ti)供的(de)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)、納(na)米(mi)粒度分(fen)析(xi)儀、紫(zi)外(wai)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)、酶(mei)標儀、讀(du)板儀等(deng)實(shi)驗(yan)室儀器(qi)設備廣泛用酶(mei)聯免(mian)疫(yi)吸(xi)附(fu)試驗(yan)、抗(kang)原檢測(ce)、外(wai)泌體研(yan)究(jiu)等。另外(wai)我們還提(ti)供細(xi)胞培(pei)養搖床、電泳(yong)儀、ELISA試劑盒(he)、96孔板、細(xi)胞培(pei)養搖瓶等。