Trizol試(shi)劑的(de)使用(yong)方(fang)法(fa)

該(gai)法(fa)從細胞(bao)中(zhong)提(ti)取(qu)RNA--用(yong)勻(yun)漿器(qi)將組(zu)織磨(mo)碎(sui)，加(jia)入(ru)TRIzol處(chu)理組(zu)織。5分(fen)鐘(zhong)後加(jia)入(ru)氯(lv)仿(fang)，以每(mei)分(fen)鐘(zhong)12000轉離心(xin)5分(fen)鐘(zhong)，樣品(pin)即(ji)分(fen)成(cheng)水(shui)樣層、中(zhong)間(jian)層和有機層(ceng)。

※RNA存在(zai)於(yu)水(shui)樣層中(zhong)，收(shou)集(ji)水(shui)樣層後可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)異(yi)丙(bing)醇沈(chen)澱(dian)RNA來還(hai)原(yuan)。

※在(zai)除去(qu)水(shui)樣層後，中(zhong)間(jian)層中(zhong)的(de)DNA和蛋(dan)白(bai)質(zhi)也(ye)能相繼以(yi)沈(chen)澱(dian)的(de)方(fang)式(shi)還(hai)原(yuan):乙(yi)醇能使中(zhong)間(jian)層的(de)DNA沈(chen)澱(dian)析出，在(zai)中(zhong)間(jian)層中(zhong)加(jia)入(ru)異(yi)丙(bing)醇能沈(chen)澱(dian)出蛋(dan)白(bai)質(zhi)。

每(mei)100ml TRIzol可(ke)以(yi)抽提(ti)100個(ge)六孔(kong)板(ban)中(zhong)的(de)樣品(pin)或100個(ge)50-80mg的(de)組(zu)織樣(yang)品(pin)。無論(lun)樣(yang)品(pin)是(shi)人(ren)、動物、植(zhi)物還(hai)是細菌(jun)組(zu)織，該(gai)方(fang)法(fa)對(dui)少(shao)量的(de)組(zu)織(50-100mg)和細胞(bao)(約五(wu)百(bai)萬(wan)個)及大量(liang)的(de)組(zu)織(≥1g)和細胞(bao)(超(chao)過(guo)壹千(qian)萬(wan)個)均有較(jiao)好的(de)分(fen)離效(xiao)果(guo)。

每(mei)壹百(bai)萬(wan)細胞(bao)用(yong)TRIzol抽提(ti)可(ke)得(de)5-15微(wei)克(ke)RNA，每(mei)毫克(ke)組(zu)織用(yong)TRIzol抽提(ti)可(ke)得(de)1-10微(wei)克(ke)RNA(產(chan)量因(yin)細胞(bao)和組(zu)織不(bu)同(tong)而(er)異(yi))。

TRIzol操作上的(de)簡便(bian)性(xing)允許其(qi)同(tong)時(shi)處(chu)理多個樣品(pin)，所(suo)有的(de)操作(zuo)可(ke)以(yi)在(zai)壹小時(shi)內完(wan)成(cheng)。

TRIzol抽提(ti)的(de)總RNA能夠避免(mian)DNA和蛋(dan)白(bai)質(zhi)的(de)汙染(ran)，故(gu)而(er)能夠作RNA 印(yin)跡(ji)分(fen)析、斑(ban)點雜交、poly(A)+ 選(xuan)擇(ze)、體(ti)外翻(fan)譯(yi)、RNA酶(mei)保(bao)護分(fen)析和單分(fen)子(zi)克(ke)隆(long)(PCR)。

※如(ru)果是(shi)用(yong)於(yu)PCR，當(dang)兩條引(yin)物位(wei)於(yu)單壹外顯(xian)子內時(shi)，建議(yi)用(yong)級聯(lian)擴大的(de)DNase I(Cat. No. 18068)來處(chu)理抽提(ti)的(de)總RNA。

※TRIzol試(shi)劑能促(cu)進不同(tong)種(zhong)屬(shu)、不(bu)同(tong)分(fen)子(zi)量大小的(de)多種RNA的(de)析出。例如(ru)，從大(da)鼠肝臟(zang)抽提(ti)的(de)RNA經過(guo)瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳並(bing)用(yong)溴化乙(yi)啶(ding)染(ran)色，可(ke)見許多介於(yu)7kb和15kb之間(jian)的(de)不連續的(de)高分(fen)子(zi)量條帶(mRNA和hnRNA成(cheng)分(fen))，兩條優勢(shi)核糖體(ti)RNA條(tiao)帶(dai)位(wei)於(yu)~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分(fen)子(zi)量RNA介於(yu)0.1和0.3kb之間(jian) (tRNA,5S)。當(dang)抽提(ti)的(de)RNA用(yong)TE稀釋(shi)時(shi)，其(qi)A260/A280比(bi)值(zhi)≥1.8。抽提(ti)小RNA時(shi)宜-70℃沈(chen)澱(dian)過(guo)夜(ye)。

TRIzol對(dui)人體(ti)有害(hai)，使用(yong)時(shi)應戴壹次(ci)性(xing)手(shou)套(tao)，註意防(fang)止(zhi)濺(jian)出(chu)。

⒈樣(yang)品(pin)的(de)制備(bei) 當(dang)樣(yang)品(pin)富(fu)含(han)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，脂(zhi)肪(fang)，多糖或是(shi)細胞(bao)外物(wu)質例如(ru)肌肉(rou)，脂(zhi)肪(fang)組(zu)織和植(zhi)物的(de)塊(kuai)莖(jing)部分(fen)時(shi)可(ke)能需(xu)要壹額外的(de)分(fen)離步(bu)驟(zhou)。勻(yun)漿化(hua)後在(zai)2-8°C的(de)條件(jian)下以12,000×g的(de)離心(xin)力(li)離心(xin)10分(fen)鐘(zhong)，移(yi)除勻(yun)漿中(zhong)不(bu)溶解(jie)的(de)物質(zhi)，余(yu)下的(de)沈(chen)澱(dian)中(zhong)包含(han)有細胞(bao)外膜(mo)，多糖，以及高分(fen)子(zi)量DNA，而(er)上層(ceng)的(de)超(chao)浮(fu)遊(you)物(wu)含(han)有RNA。在(zai)來自(zi)於(yu)脂(zhi)肪(fang)組(zu)織的(de)樣品(pin)中(zhong)，大(da)量(liang)的(de)脂(zhi)肪(fang)漂在(zai)最(zui)上層因(yin)而(er)應該(gai)除掉。在(zai)每(mei)壹個(ge)個(ge)案中(zhong)，將清(qing)亮(liang)的(de)勻(yun)漿溶液轉移(yi)到(dao)壹幹(gan)凈的(de)試(shi)管中(zhong)加(jia)入(ru)氯(lv)仿(fang)並(bing)繼(ji)續進行下述(shu)的(de)分(fen)離步(bu)驟(zhou)。

⒉ 分(fen)離階(jie)段 將勻(yun)漿樣(yang)品(pin)在(zai)15-30°C條(tiao)件(jian)下孵(fu)育(yu)5分(fen)鐘(zhong)以使核蛋(dan)白(bai)體(ti)分(fen)解(jie)。每(mei)1 ml TRIZOL加(jia)0.2 ml氯(lv)仿。蓋(gai)緊樣品(pin)管(guan)蓋(gai)，用(yong)手用(yong)力(li)搖(yao)晃(huang)試(shi)管15秒(miao)並(bing)將其(qi)在(zai)30°C下孵(fu)育(yu)2-3分(fen)鐘(zhong)。在(zai)2-8°C下以不超(chao)過(guo)12,000×g的(de)離心(xin)力(li)高(gao)速冷凍(dong)離心(xin)15分(fen)鐘(zhong)。離心(xin)後(hou)混(hun)合(he)物(wu)分(fen)成(cheng)三層(ceng):下層紅色(se)的(de)苯酚(fen)-氯(lv)仿層，中(zhong)間(jian)層，上(shang)層無色的(de)水(shui)樣層。RNA無壹例外地(di)存在(zai)於(yu)水(shui)樣層當(dang)中(zhong)。水(shui)樣層的(de)容(rong)量(liang)大(da)約(yue)為(wei)所(suo)加(jia)TRIZOL容(rong)量(liang)的(de)60%。

⒊ RNA的(de)沈(chen)澱(dian) 將水(shui)樣層轉移(yi)到(dao)壹幹(gan)凈的(de)試(shi)管中(zhong)，如(ru)果(guo)希(xi)望分(fen)離DNA和蛋(dan)白(bai)，有機層(ceng)同(tong)樣要予(yu)以(yi)保(bao)留(liu)。通(tong)過(guo)將水(shui)樣層和異(yi)丙(bing)醇混合(he)來沈(chen)澱(dian)RNA。最(zui)初均化時(shi)的(de)每(mei)1 ml TRIZOL對應(ying)0.5 ml異(yi)丙(bing)醇。將混(hun)合(he)的(de)樣品(pin)在(zai)15-30°C條(tiao)件(jian)下孵(fu)育(yu)10分(fen)鐘(zhong)並(bing)在(zai)2-8°C下以不超(chao)過(guo)12,000×g的(de)離心(xin)力(li)高(gao)速冷凍(dong)離心(xin)10分(fen)鐘(zhong)。RNA沈(chen)澱(dian)在(zai)離心(xin)前通(tong)常不(bu)可(ke)見，形成(cheng)壹膠(jiao)狀片狀沈(chen)澱(dian)附著(zhe)於(yu)試(shi)管壁(bi)和管底(di)。

4 .RNA的(de)洗脫(tuo) 移(yi)去(qu)上層(ceng)懸(xuan)液。用(yong)75%的(de)乙醇洗滌(di)RNA沈(chen)澱(dian)壹次(ci)，每(mei)1 ml的(de) TRIZOL至少(shao)加(jia)1 ml的(de)75%乙醇。旋渦(wo)振蕩(dang)混(hun)合(he)樣(yang)品(pin)並(bing)在(zai)2-8°C下以不超(chao)過(guo)7,500×g的(de)離心(xin)力(li)高(gao)速冷凍(dong)離心(xin)5分(fen)鐘(zhong)。

⒌ RNA的(de)再溶解(jie) 在(zai)操(cao)作(zuo)的(de)最(zui)後，簡單幹(gan)燥RNA沈(chen)澱(dian)(空(kong)氣幹燥(zao)或真空(kong)幹(gan)燥(zao)5-10分(fen)鐘(zhong))不要在(zai)真空(kong)管(guan)裏(li)離心(xin)幹(gan)燥(zao)RNA。尤(you)為(wei)重要的(de)是，不(bu)能讓RNA沈(chen)澱(dian)幹燥(zao)那樣(yang)會極大地降低(di)它(ta)的(de)可(ke)溶性(xing)。部(bu)分(fen)溶解(jie)的(de)RNA樣品(pin)其(qi)A260/280比(bi)值(zhi)< 1.6。用(yong)移(yi)液管尖(jian)分(fen)幾次(ci)移(yi)取(qu)無RNA酶(mei)的(de)水(shui)或0.5% SDS溶液來溶解(jie)RNA，並(bing)在(zai)55-60°C下孵(fu)育(yu)10分(fen)鐘(zhong)(當(dang)RNA以(yi)後(hou)要用(yong)於(yu)酶(mei)切反應(ying)時(shi)，避免(mian)使用(yong)SDS。)RNA還能被100%甲(jia)酰(xian)胺(an)(除去(qu)離子(zi))再(zai)溶解(jie)並(bing)保(bao)存在(zai)–70°C。