使用流式細胞儀(yi)檢測(ce)血(xue)小(xiao)板(ban)的(de)註意事項(xiang)

 通(tong)過(guo)使用使用流式細胞儀(yi)可(ke)以(yi)對(dui)血(xue)小(xiao)板(ban)進行(xing)信號傳遞(di)、細胞骨(gu)架 架構(gou)、糖蛋白(bai)結構、血(xue)小(xiao)板(ban)活化反應， 糖蛋白(bai)缺陷檢(jian)測(ce)， RNA含(han)量(liang)，血(xue)小(xiao)板(ban)抗體等(deng)分析檢(jian)測(ce)。使(shi)用流式細胞儀(yi)進行(xing)血(xue)小(xiao)板(ban)分析檢測(ce)時(shi)需(xu)要註意以下(xia)幾點：
壹)抗體的(de)選擇(ze)
選擇(ze)CDWorkshop中(zhong)的(de)單(dan)克隆抗(kang)體.單(dan)克隆抗(kang)體反應特異性高,非特異性結合(he)少,
但(dan)由(you)於血(xue)小(xiao)板(ban)富含(han)FcRⅡ(CD32,Fe Ⅱ受(shou)體),而Fc受(shou)體對不(bu)同(tong)抗(kang)體亞類具(ju)有(you)不(bu)同(tong)親和力(li),所(suo)以在業(ye)類選擇(ze)上,對(dui)於人的(de)抗體以選擇(ze)IgG1為好(hao).
二)抗凝(ning)劑的(de)選擇(ze)
盡量(liang)避(bi)免(mian)使用肝素(su);EDTA在(zai)室溫(wen)20~25℃時(shi)其(qi)抗凝效(xiao)果(guo)與枸(gou)椽酸(suan)鹽無(wu)差(cha)別(bie),但(dan)在(zai)37℃時(shi),EDTA就(jiu)會(hui)影(ying)響(xiang)蛋白(bai)結構及刺激(ji)血(xue)小(xiao)板(ban)活化.
三)標(biao)本的(de)采(cai)集
般(ban)采(cai)少量(liang)外周(zhou)血(xue),收集在玻璃容器(qi)或(huo)塑(su)料(liao)容(rong)器(qi)中(zhong),采(cai)血(xue)中(zhong)避(bi)免(mian)組(zu)織(zhi)液(ye)流人血(xue)液(ye)中(zhong);防(fang)止(zhi)氣泡(pao)產生(sheng);並(bing)使(shi)用大(da)號針(zhen)頭(如18號).盡量(liang)減少(shao)化學、物(wu)理(li)的(de)激(ji)活因素(su)對(dui)血(xue)小(xiao)板(ban)的(de)活化作(zuo)用.標本(ben)的(de)放(fang)置溫(wen)度以(yi)15-25℃為宜,4~10℃以(yi)下(xia)血(xue)小(xiao)板(ban)的(de)外形發(fa)生(sheng)改(gai)變(bian).
四)抗(kang)體標記(ji)物(wu)的(de)選擇(ze)
我們知(zhi)道(dao),FITC和PE標記是(shi)常用的(de)在488nm激(ji)發(fa)下(xia)作(zuo)為雙標(biao)記(ji)使用的(de)試(shi)劑,PE的(de)熒(ying)光強(qiang)度比(bi)FITC強.因(yin)為在用單(dan)色測(ce)定中(zhong)CD62p和CD63在靜止(zhi)血(xue)小(xiao)板(ban)上均(jun)為弱(ruo)表(biao)達(da),檢(jian)測(ce)這兩個抗原(yuan)時(shi)用PE標記(ji)為宜.而(er)當(dang)CD62p和CD63配(pei)合(he)壹個高強(qiang)度(du)表(biao)達(da)的(de)抗原CD41、CD61或(huo)CD42b作(zuo)為雙標(biao)記(ji)時(shi),CD62p和CD63卻(que)宜使(shi)用FITC標記(ji).
五(wu))樣品固定
使用流式細胞儀(yi)同(tong)樣可(ke)以(yi)檢(jian)測(ce)樣本(ben)中(zhong)的(de)血(xue)小(xiao)板(ban)反應力(li)及(ji)活化進程；樣本(ben)的(de)固定的(de)主要目(mu)的(de)為了減(jian)少(shao)血(xue)小(xiao)板(ban)的(de)體外活化,在(zai)進行(xing)樣本(ben)固定時(shi)，也(ye)可(ke)能會(hui)破壞(huai)部(bu)分(fen)蛋白(bai)質(zhi)結構,從而增(zeng)加非(fei)特異性染色.所(suo)以,除了(le)做體外剌激(ji)血(xue)小(xiao)板(ban)活化研(yan)究和不能及時(shi)處(chu)理(li)標(biao)本外,都應該做標記(ji)之(zhi)後(hou)再固定.樣本(ben)固定劑壹般(ban)使(shi)用0.5%~1.0%的(de)多(duo)聚(ju)甲(jia)醛(quan)即可(ke).
六(liu))緩沖液(ye)
在孵育和洗(xi)滌過(guo)程中(zhong)經常會(hui)使(shi)用PBS(0.01 mol/LpH7.2)+BSA.但(dan)如(ru)果(guo)是分(fen)析血(xue)小(xiao)板(ban)活化過(guo)程(cheng)，由(you)於Tyrode緩沖液(ye)中(zhong)主(zhu)要(yao)含(han)有(you)鎂(mei)離(li)子和grape sugar,這兩種(zhong)物(wu)質(zhi)有(you)利(li)於減少(shao)血(xue)小(xiao)板(ban)的(de)體外活化。所(suo)以在洗(xi)滌的(de)時(shi)候(hou),也可(ke)以(yi)使(shi)用Tyrode緩沖液(ye)。
七(qi))儀(yi)器(qi)的(de)設(she)置(zhi)
部(bu)分(fen)的(de)流失細胞儀(yi)需要(yao)利(li)用熒(ying)光微(wei)球(qiu)微(wei)球(qiu)進行(xing)儀器(qi)光(guang)路(lu)和光電(dian)信號的(de)控制(zhi),使儀器(qi)保持相(xiang)對穩定、靈敏的(de)狀(zhuang)態.當(dang)數據采(cai)集完(wan)成以後(hou),散射光和熒(ying)光需(xu)要使(shi)用對數放(fang)大(da),這時(shi)通(tong)過(guo)調節(jie)散射光電(dian)壓(ya),使(shi)細胞群(qun)分(fen)布盡量(liang)保持在中(zhong)間位(wei)置(zhi).調(tiao)節(jie)熒(ying)光電(dian)壓(ya),使(shi)樣品繼發(fa)熒(ying)光強(qiang)度落(luo)在對(dui)數值(zhi)1內(nei),也可(ke)以(yi)使(shi)用熒(ying)光微(wei)球(qiu)或(huo)者使用CD4-FITC/CD8-PE雙色(se)標記(ji)單(dan)抗來做熒(ying)光補(bu)償(chang).標(biao)本(ben)至(zhi)少分析5000個細胞,而(er)且每(mei)秒流速不(bu)宜超(chao)過(guo)1000~1500個細胞.
八(ba)）數據分(fen)析
在(zai)活化血(xue)小(xiao)板(ban)(CD62p、CD63)等(deng)少量表(biao)達(da)抗(kang)原(yuan)的(de)檢測(ce)中(zhong),閾(yu)值(zhi)的(de)設(she)定壹般(ban)是(shi)使(shi)非特異性染色的(de)比例控制(zhi)在1%~2%的(de)範圍內(nei),但(dan)要(yao)對非特異性染色進行(xing)正(zheng)確(que)的(de)設(she)定依(yi)靠(kao)儀(yi)器(qi)的(de)敏感(gan)度(du)及(ji)試(shi)劑的(de)質量.當(dang)測(ce)定的(de)抗原本(ben)身為高表(biao)達(da)而(er)要(yao)判(pan)斷(duan)抗(kang)原表(biao)達(da)的(de)高低度(du)時(shi),需(xu)要依(yi)據(ju)平均(jun)熒(ying)光強(qiang)度。
         蘇州(zhou)阿(e)爾法(fa)生(sheng)物(wu)14年(nian)專(zhuan)註於生(sheng)物(wu)實(shi)驗(yan)室(shi)儀(yi)器(qi)設(she)備(bei)的(de)供應，所(suo)提(ti)供的(de)Luminex系(xi)列細胞分(fen)析儀(yi)主要包括Amnis CellStream流式細胞儀(yi)，FlowSight多(duo)維(wei)全景流(liu)式細胞分(fen)析儀(yi) ；Guava easyCyte微(wei)毛(mao)管(guan)細胞分(fen)析儀(yi)，Amnis ImageStream x Mk II量化成(cheng)像分析(xi)流(liu)式細胞儀(yi)以及(ji)Muse細胞分(fen)析儀(yi)等(deng)廣泛應用於細胞周(zhou)期(qi)檢(jian)查，抗體識別(bie)，細胞雕(diao)亡檢(jian)測(ce)，細胞外泌(mi)體檢測(ce)，細胞結構研究，以(yi)及(ji)血(xue)小(xiao)板(ban)細胞分(fen)析等(deng)等(deng)細胞生(sheng)物(wu)學領域。