Western實驗步(bu)驟(zhou)

Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡(ji)，常簡寫為(wei)WB，是用抗(kang)體(ti)檢測蛋白(bai)表(biao)達的重(zhong)要方法之(zhi)壹。碧(bi)雲(yun)天試劑總結(jie)Western實驗步(bu)驟(zhou)可如(ru)下進(jin)行(xing)操作。

1.收集蛋白(bai)樣(yang)品(Protein sample preparation)

根(gen)據實驗需(xu)要，使(shi)用適當的裂(lie)解(jie)液(ye)，例(li)如(ru)碧(bi)雲(yun)天(tian)生產(chan)的Western及(ji)IP細(xi)胞(bao)裂(lie)解(jie)液(ye)(P0013/ P0013J)、RIPA裂(lie)解(jie)液(ye)(P0013B/ P0013C/
P0013D/ P0013K)、 NP-40裂(lie)解(jie)液(ye)(P0013F)或SDS裂(lie)解(jie)液(ye)(P0013G)等(deng)，裂(lie)解(jie)貼(tie)壁(bi)細(xi)胞(bao)、懸浮(fu)細(xi)胞(bao)或組(zu)織樣(yang)品；為(wei)了(le)防(fang)止蛋白(bai)的降解(jie)，或保(bao)證(zheng)磷(lin)酸(suan)化(hua)或乙(yi)酰(xian)化(hua)蛋白(bai)的穩定(ding)，也(ye)可額(e)外(wai)添加(jia)蛋白(bai)酶(mei)抑制劑、磷(lin)酸(suan)酶(mei)抑制劑或去(qu)乙(yi)酰化(hua)酶(mei)抑制劑混合(he)物( P1005/ P1006/P1045/ P1046/ P1112/P1113)。對(dui)於某(mou)些特(te)定(ding)的亞(ya)細(xi)胞(bao)組(zu)份(fen)蛋白(bai)，例(li)如(ru)細(xi)胞(bao)核蛋白(bai)、細(xi)胞(bao)漿(jiang)蛋白(bai)、線(xian)粒(li)體(ti)蛋白(bai)等(deng)，可以(yi)參考(kao)相關文(wen)獻(xian)提取(qu)這些亞(ya)細(xi)胞(bao)組(zu)份(fen)蛋白(bai)，也(ye)可以(yi)使用試劑盒進(jin)行(xing)抽(chou)提，例(li)如(ru)碧(bi)雲(yun)天(tian)生產(chan)的細(xi)胞(bao)核蛋白(bai)與細(xi)胞(bao)漿(jiang)蛋白(bai)抽(chou)提試劑盒( P0027和P0028)、 細(xi)胞(bao)膜蛋白(bai)與細(xi)胞(bao)漿(jiang)蛋白(bai)提(ti)取試劑盒(P0033)、 細(xi)胞(bao)線(xian)粒(li)體(ti)分離試劑盒(C3601)、 組(zu)織線(xian)粒(li)體(ti)分離試劑盒(C3606)。

收集完蛋白(bai)樣(yang)品後(hou)，為(wei)確保(bao)每個(ge)蛋白(bai)樣(yang)品的上樣(yang)量壹致，需(xu)要測定(ding)每個(ge)蛋白(bai)樣(yang)品的蛋白(bai)濃度。根據所(suo)使用(yong)的裂(lie)解(jie)液(ye)的不同，需(xu)要采用適當的蛋白(bai)濃度測定(ding)方法。因為不同的蛋白(bai)濃度測定(ding)方法對(dui)於壹(yi)些去(qu)垢(gou)劑和還(hai)原劑(ji)等的兼容(rong)性(xing)差(cha)別(bie)很(hen)大(da)。如(ru)果使(shi)用(yong)碧雲(yun)天生產(chan)的Western及(ji)IP細(xi)胞(bao)裂(lie)解(jie)液(ye)(P0013)、RIPA裂(lie)解(jie)液(ye)，可(ke)以(yi)使(shi)用BCA蛋白(bai)濃度測定(ding)試劑盒( P0009/ P0010/ P0010S/ P0011/ P0012/ P0012S)、 Bradford蛋白(bai)濃度測定(ding)試劑盒(去(qu)垢(gou)劑兼(jian)容(rong)型(xing))(P0006C)。

2.電(dian)泳(Electrophoresis)
(1)  SDS-PAGE凝(ning)膠配(pei)制

SDS-PAGE凝膠可以(yi)參考(kao)壹(yi)些文獻(xian)資料進(jin)行(xing)配(pei)制，也可以使(shi)用(yong)碧(bi)雲天(tian)試劑、天能SDS-PAGE凝(ning)膠(jiao)預(yu)制膠、SDS-PAGE凝膠配(pei)制試劑盒(P0012A)、SDS-PAGE凝(ning)膠(jiao)快速配(pei)制試劑盒(P0012AC)。這(zhe)兩(liang)種試劑盒提(ti)供了(le)除水和配(pei)膠(jiao)器具(ju)外(wai)的所有試劑以及(ji)配(pei)制各種濃度SDS-PAGE的配(pei)方。更(geng)方便(bian)的，可以使(shi)用(yong)碧雲(yun)天(tian)的各種濃度規格(ge)的預制膠產(chan)品(pin)( P0050/ P0051/P0052/ P0053/ P0055/ P0056/ P0057/ P0058)。

(2)  樣(yang)品處(chu)理(li)

在收集的蛋白(bai)樣(yang)品中(zhong)加(jia)入適量濃縮(suo)的SDS-PAGE蛋白(bai)上(shang)樣(yang)緩沖(chong)液(ye)。例(li)如(ru)2X或5X的SDS-PAGE蛋白(bai)上(shang)樣(yang)緩沖(chong)液(ye)。使用(yong)5X的SDS-PAGE蛋白(bai)上(shang)樣(yang)緩沖(chong)液(ye)可以(yi)減小上樣(yang)體(ti)積(ji)，在相同體(ti)積(ji)的上樣(yang)孔(kong)內(nei)可以(yi)上樣(yang)更多(duo)的蛋白(bai)樣(yang)品。5X的SDS-PAGE蛋白(bai)上(shang)樣(yang)緩沖(chong)液(ye)可以(yi)參考(kao)相關文(wen)獻(xian)資料配(pei)制，也可以使(shi)用(yong)碧(bi)雲天(tian)生產(chan)的SDS-PAGE蛋白(bai)上(shang)樣(yang)緩沖(chong)液(ye)(5X)(P0015)或 SDS-PAGE蛋白(bai)上(shang)樣(yang)緩沖(chong)液(ye)(5X) (P0015L)。 如(ru)果是非變(bian)性(xing)樣(yang)品，可(ke)以(yi)使用(yong) 非變(bian)性(xing)PAGE蛋白(bai)上(shang)樣(yang)緩沖(chong)液(ye)(P0016)或非(fei)變(bian)性(xing)非(fei)還(hai)原性(xing)蛋白(bai)上(shang)樣(yang)緩沖(chong)液(ye)(P0016N)。

100℃或沸(fei)水浴加熱(re)3-5分鐘，以充(chong)分變(bian)性(xing)蛋白(bai)。

(3)  上(shang)樣(yang)與電(dian)泳

蛋白(bai)樣(yang)品冷卻(que)到(dao)室(shi)溫(wen)後(hou)，直(zhi)接(jie)上(shang)樣(yang)到(dao)SDS-PAGE膠(jiao)加(jia)樣(yang)孔(kong)內(nei)即可。

碧(bi)雲(yun)天(tian)提供各種預染(ran)蛋白(bai)質(zhi)分子(zi)量標準用於(yu)觀察電(dian)泳效(xiao)果和轉(zhuan)膜效(xiao)果，以(yi)及(ji)判斷蛋白(bai)分子(zi)量大小。最好(hao)使(shi)用(yong)彩色預(yu)染蛋白(bai)質(zhi)分子(zi)量標準(P0068/P0069/P0071/P0072/ P0075/P0076/P0077/P0078/P0079/P0080)或預(yu)染(ran)蛋白(bai)質(zhi)分子(zi)量標準( P0066/ P0067)。

電(dian)泳時(shi)電(dian)泳液(ye)可以(yi)使(shi)用(yong)碧雲天生產(chan)的SDS-PAGE電(dian)泳液(ye)(P0014A/P0014B)。

電(dian)泳時(shi)通常(chang)推(tui)薦在上(shang)層(ceng)膠時(shi)使用(yong)低(di)電(dian)壓恒(heng)壓電(dian)泳，而(er)在溴(xiu)酚(fen)藍進(jin)入下層(ceng)膠時(shi)使用(yong)高(gao)電(dian)壓恒(heng)壓電(dian)泳。對(dui)於Bio-Rad的標準電(dian)泳裝(zhuang)置或類(lei)似(si)電(dian)泳裝(zhuang)置，低(di)電(dian)壓可(ke)以(yi)設置在80-100V，高(gao)電(dian)壓可(ke)以(yi)設置在120V左(zuo)右(you)。SDS-PAGE可(ke)以采用普通(tong)的電(dian)泳儀(yi)就(jiu)可以(yi)滿(man)足要求(qiu)，也可(ke)以采用碧(bi)雲(yun)天的多功能(neng)電(dian)泳儀(yi)(帶定(ding)時(shi))(EEP102)。為了(le)電(dian)泳方便(bian)起見(jian)，也可(ke)以(yi)采用整(zheng)個(ge)SDS-PAGE過(guo)程(cheng)恒壓的方式(shi)，通常把(ba)電(dian)壓設置在100V，然(ran)後(hou)設定(ding)定(ding)時(shi)時(shi)間為(wei)90-120分鐘。設置定(ding)時(shi)可以(yi)避免(mian)經(jing)常發生的電(dian)泳過(guo)頭(tou)。

通(tong)常電(dian)泳時(shi)溴酚(fen)藍到(dao)達膠的底端處(chu)附近(jin)即可停(ting)止電(dian)泳，或者(zhe)可(ke)以根(gen)據預(yu)染蛋白(bai)質(zhi)分子(zi)量標準的電(dian)泳情(qing)況(kuang)，預(yu)計(ji)目的蛋白(bai)已(yi)經(jing)被(bei)適當分離後(hou)即可停(ting)止電(dian)泳。

3. 轉(zhuan)膜(Transfer )

我們(men)推(tui)薦在Western實驗中(zhong)選用PVDF膜(FFP24/FFP26/ FFP28/FFP32/ FFP33/ FFP36/ FFP39),其中推(tui)薦使(shi)用PVDF膜(進(jin)口(kou)分裝，6.6×8.5cm,0.2μm) ( FFP24/FFP26)。PVDF膜在使(shi)用(yong)前(qian)須(xu)經(jing)浸(jin)潤和活(huo)化(hua)，推(tui)薦使(shi)用碧雲天生產(chan)的安(an)全(quan)無(wu)毒的 PVDF膜浸(jin)潤活(huo)化(hua)液(ye)(P0021S)。也(ye)可(ke)以(yi)使(shi)用硝酸(suan)纖維素(su)膜(NC膜) ( FFN02/ FFN03/FFN05/FFN06/ FFN08)，但硝(xiao)酸(suan)纖維素(su)膜比較脆(cui)，在操作過(guo)程(cheng)中特(te)別(bie)是用鑷(nie)子(zi)夾取(qu)等(deng)過(guo)程(cheng)中容(rong)易(yi)裂(lie)開。膜的使用請(qing)參考(kao)生產(chan)商(shang)的推(tui)薦使(shi)用步(bu)驟(zhou)。

轉(zhuan)膜時(shi)推(tui)薦使(shi)用碧雲天生產(chan)的高(gao)品(pin)質(zhi)轉(zhuan)印濾(lv)紙(zhi)(7.5×10cm) (FFP51)。 轉(zhuan)膜時(shi)的溶液推(tui)薦使(shi)用碧雲天的Western轉(zhuan)膜液(P0021A/P0021B)。

通(tong)常(chang)如(ru)果使(shi)用(yong)Bio-Rad的標準濕(shi)式(shi)轉(zhuan)膜裝置，可以設定(ding)轉(zhuan)膜電(dian)流(liu)為300-400mA，轉(zhuan)膜時(shi)間為(wei)30-60分鐘。也可(ke)以(yi)在15-20mA轉(zhuan)膜過(guo)夜(ye)。轉(zhuan)膜時(shi)也可(ke)以使(shi)用碧雲天(tian)的多功能(neng)電(dian)泳儀(yi)(帶定(ding)時(shi))(EEP102)。具體(ti)的轉(zhuan)膜時(shi)間要(yao)根據目的蛋白(bai)的大小而(er)定(ding)，目的蛋白(bai)的分子(zi)量越(yue)大(da)，需(xu)要的轉(zhuan)膜時(shi)間越(yue)長(chang)，目的蛋白(bai)的分子(zi)量越(yue)小(xiao)，需(xu)要的轉(zhuan)膜時(shi)間越(yue)短(duan)。

在轉(zhuan)膜過(guo)程(cheng)中，特(te)別(bie)是高(gao)電(dian)流(liu)快速轉(zhuan)膜時(shi)，通常(chang)會有非常(chang)嚴(yan)重(zhong)的發熱(re)現(xian)象(xiang)，最好(hao)把(ba)轉(zhuan)膜槽放(fang)置在冰(bing)浴(yu)中進(jin)行(xing)轉(zhuan)膜。

轉(zhuan)膜的效(xiao)果可(ke)以(yi)觀察所使用的預染蛋白(bai)質(zhi)分子(zi)量標準，通常(chang)分子(zi)量最大的1-2條帶較難全(quan)部(bu)轉(zhuan)到(dao)膜上。轉(zhuan)膜的效(xiao)果也(ye)可(ke)以用(yong)麗春紅染(ran)色液(ye)(P0022)對(dui)膜進(jin)行(xing)染色，以(yi)觀察實際(ji)的轉(zhuan)膜效(xiao)果。也(ye)可(ke)以用(yong)考(kao)馬(ma)斯(si)亮藍快速染(ran)色液(ye)(P0017)對(dui)完成(cheng)轉(zhuan)膜的SDS-PAGE膠進(jin)行(xing)染色，以(yi)觀察蛋白(bai)的殘留情(qing)況(kuang)。

4.封閉(bi)(Blocking)

轉(zhuan)膜完畢後(hou)，立(li)即把(ba)蛋白(bai)膜放置到(dao)預(yu)先(xian)加(jia)入Western洗滌(di)液(ye)(P0023C/P0023C3/ P0023C6)的Western洗膜盒(FFX050/ FFX052/ FFX055)中(zhong)，漂(piao)洗(xi)1-2分鐘，以洗(xi)去(qu)膜上的轉(zhuan)膜液。從(cong)轉(zhuan)膜完畢後(hou)所(suo)有的步(bu)驟(zhou)，壹定(ding)要(yao)註意膜的保濕，避(bi)免(mian)膜的幹燥(zao)，否(fou)則(ze)極易(yi)產(chan)生較高(gao)的背(bei)景(jing)。

用微型臺式真(zhen)空泵(E0110/E0111/ E0112/E0113/ E0114/ E0115)或滴(di)管(guan)等吸(xi)盡洗(xi)滌液，優(you)先(xian)推(tui)薦加(jia)入適量的 QuickBlock™ Western封閉(bi)液(P0252)，在搖(yao)床(chuang)上緩(huan)慢搖動(dong)，室(shi)溫(wen)封閉(bi)10分鐘；也可(ke)以(yi)加(jia)入 Western封閉(bi)液(P0023B)，在搖(yao)床(chuang)上緩(huan)慢搖動(dong),室(shi)溫(wen)封閉(bi)60分鐘。對(dui)於壹(yi)些背(bei)景(jing)較高(gao)的抗(kang)體(ti)，兩(liang)種封閉(bi)液都(dou)可(ke)以適當延長(chang)封閉(bi)時(shi)間，如(ru)有必要甚(shen)至(zhi)可(ke)以4℃封閉(bi)過(guo)夜(ye)。在整(zheng)個(ge)Western過(guo)程(cheng)中我(wo)們推(tui)薦使(shi)用碧雲天的 側(ce)擺搖(yao)床( E0016-E0030)或類(lei)似(si)儀器，側(ce)向擺動(dong)速度比較緩(huan)慢，而且(qie)也(ye)容(rong)易(yi)讓溶(rong)液(ye)覆(fu)蓋蛋白(bai)膜。

5.壹抗(kang)孵(fu)育(Primary antibody incubation )

參考(kao)壹(yi)抗(kang)的說明書，按照適當比(bi)例(li)用(yong)QuickBlock™ Western壹(yi)抗(kang)稀(xi)釋液(P0256)或Western壹(yi)抗(kang)稀(xi)釋液(P0023A)稀(xi)釋壹抗(kang), ，碧雲(yun)天提(ti)供了(le)近千(qian)種 優(you)質(zhi)壹(yi)抗(kang)。

用微型臺式真(zhen)空泵或滴(di)管(guan)等吸(xi)盡封閉(bi)液，立(li)即加入稀(xi)釋好的壹抗(kang)，室溫(wen)或4℃在側(ce)擺搖(yao)床上(shang)緩慢搖動(dong)孵(fu)育壹(yi)小(xiao)時(shi)。如(ru)果壹(yi)抗(kang)孵(fu)育壹(yi)小(xiao)時(shi)效(xiao)果不佳(jia)，可以(yi)4℃緩慢搖動(dong)孵(fu)育過(guo)夜(ye)。或更(geng)據抗(kang)體(ti)的說明選擇(ze)適當的孵(fu)育溫(wen)度和時(shi)間。

回(hui)收壹抗(kang)。加入Western洗滌(di)液(ye)(P0023C/P0023C3/ P0023C6)，在側(ce)擺搖(yao)床上(shang)緩慢搖動(dong)洗(xi)滌5-10分鐘。吸盡(jin)洗(xi)滌(di)液後(hou)，再(zai)加入洗滌(di)液(ye)洗滌(di)5-10分鐘。共洗(xi)滌(di)3次(ci)。如(ru)果結(jie)果背(bei)景(jing)較高(gao)可(ke)以(yi)適當延長(chang)洗滌(di)時(shi)間並(bing)增加洗(xi)滌(di)次(ci)數(shu)。

註：Western結(jie)果通(tong)常(chang)需(xu)要提(ti)供內(nei)參作為對(dui)照，通常可以(yi)選(xuan)用(yong)Tubulin抗(kang)體(ti)(AT819/AF0001)、Actin抗(kang)體(ti)( AA128/ AF0003)或GAPDH抗(kang)體(ti)(AG019/ AF0006)，進(jin)行(xing)內(nei)參檢(jian)測。

6. 二抗(kang)孵(fu)育(Secondary antibody incubation)

參考(kao)二抗(kang)的說明書，按照適當比(bi)例(li)用(yong)QuickBlock™ Western二抗(kang)稀(xi)釋液(P0258)或Western二抗(kang)稀(xi)釋液(P0023D)稀(xi)釋辣根過(guo)氧化(hua)物酶(mei)(HRP)或堿性磷(lin)酸(suan)酶(mei)(AP)等(deng)標記的二抗(kang)。二抗(kang)需(xu)根據壹(yi)抗(kang)進(jin)行(xing)選擇(ze)，例(li)如(ru)，壹(yi)抗(kang)是小鼠來源(yuan)的IgG，則二抗(kang)需(xu)選擇(ze)抗(kang)小鼠(shu)IgG的二抗(kang)，如(ru) 辣根過(guo)氧化(hua)物酶(mei)標(biao)記山(shan)羊(yang)抗(kang)小鼠(shu)IgG(H+L)(A0216)。碧雲(yun)天有 多種二抗(kang)提供。

用微型臺式真(zhen)空泵或滴(di)管(guan)等吸(xi)盡洗(xi)滌液，立即加入稀(xi)釋好的二抗(kang)，室溫(wen)或4℃在側(ce)擺搖(yao)床上(shang)緩慢搖動(dong)孵(fu)育壹(yi)小(xiao)時(shi)。

回(hui)收二抗(kang)。加入Western洗滌(di)液(ye)(P0023C/P0023C3/ P0023C6)，在側(ce)擺搖(yao)床上(shang)緩慢搖動(dong)洗(xi)滌5-10分鐘。吸盡(jin)洗(xi)滌(di)液後(hou)，再(zai)加入洗滌(di)液(ye)洗滌(di)5-10分鐘。共洗(xi)滌(di)3次(ci)。如(ru)果結(jie)果背(bei)景(jing)較高(gao)可(ke)以(yi)適當延長(chang)洗滌(di)時(shi)間並(bing)增加洗(xi)滌(di)次(ci)數(shu)。

7.  蛋白(bai)檢(jian)測(Detection of proteins) 

參考(kao)相關說(shuo)明書，使用BeyoECL Star (P0018A)或BeyoECL Plus(P0018)等(deng)ECL類(lei)試劑來檢測蛋白(bai)。壓片(pian)可(ke)以(yi)采用專(zhuan)用(yong)的壓片(pian)暗(an)盒( FFC58/ FFC83)進(jin)行(xing)。也可以使(shi)用(yong)DAB辣根過(guo)氧化(hua)物酶(mei)顯色試劑盒( P0202/ P0203)、TMB顯色液(ye)(組(zu)化(hua)或膜HRP顯色用(yong)) (P0211)或 BCIP/NBT堿性磷(lin)酸(suan)酯酶(mei)顯色試劑盒(C3206)。

洗(xi)片(pian)時(shi)可以(yi)使用(yong)X光(guang)片自(zi)動(dong)洗片機。如(ru)果沒有自(zi)動(dong)洗片機，可(ke)以(yi)用(yong)顯影(ying)定(ding)影(ying)試劑盒(P0019/P0020)自(zi)行(xing)配(pei)制顯影(ying)液和定(ding)影(ying)液進(jin)行(xing)手工(gong)洗片(pian)。X光(guang)片推(tui)薦選(xuan)用原柯達生產(chan)的生物實驗專(zhuan)用(yong)X-OMAT BT膠片( FF057/ FF081)。

8. 膜的重(zhong)復(fu)利(li)用(yong)(Membrane recovery ) 

如(ru)果蛋白(bai)樣(yang)品非(fei)常(chang)寶貴(gui)，可(ke)以(yi)使(shi)用(yong)Western壹抗(kang)二抗(kang)去(qu)除液(P0025/P0025B/ P0025N/ P0025S)處(chu)理(li)蛋白(bai)膜，以重(zhong)復(fu)利(li)用(yong)蛋白(bai)膜。

實驗試劑由蘇(su)州阿(e)爾(er)法生物提供。