蛋(dan)白抗(kang)體生(sheng)產過(guo)程(cheng)中瞬時轉染的(de)優(you)化方(fang)案(an)

隨著藥物靶點復(fu)雜性(xing)的(de)增(zeng)加(jia)，哺(bu)乳(ru)動物(wu)細(xi)胞(bao)系(xi)統(tong)中的(de)基(ji)因(yin)重(zhong)組蛋(dan)白質(zhi)生(sheng)產變(bian)得越來(lai)越普(pu)遍(bian)。通過瞬時轉染的(de)方(fang)式(shi) 適(shi)當(dang)的(de)進(jin)行(xing)蛋(dan)白質(zhi)的(de)折疊(die)、組裝和翻譯(yi)後修(xiu)飾(shi)對於哺(bu)乳(ru)動物(wu)細(xi)胞(bao)表(biao)達(da)也(ye)具(ju)有重(zhong)要(yao)的(de)意義 。 

  源自(zi) CHO 和 HEK 293 細(xi)胞(bao)的(de)懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞(bao)系(xi)通常(chang)用(yong)於哺(bu)乳(ru)動物(wu)蛋(dan)白質(zhi)生(sheng)產。這些細(xi)胞(bao)系(xi)具(ju)有許(xu)多(duo)理想的(de)特性(xing)，包括(kuo)高(gao)表(biao)達(da)水(shui)平、可(ke)擴展(zhan)性(xing)（密度和(he)體積(ji)）等(deng)等(deng)。

部分(fen)基(ji)因(yin)藥(yao)物會使用(yong)穩定的(de)轉染劑(ji)，以實現批(pi)次間(jian)的(de)壹致性(xing)和大(da)規(gui)模(mo)的(de)低成本。在過去十年(nian)中的(de)細(xi)胞(bao)轉染方(fang)面(mian)也(ye)有著許(xu)多(duo)進(jin)展(zhan)，瞬時轉染方(fang)法在改進(jin)的(de)細(xi)胞(bao)系(xi)、表(biao)達(da)載(zai)體、培養基(ji)和遞(di)送方(fang)法、哺乳動物(wu)蛋(dan)白表(biao)達(da)等(deng)方(fang)面(mian)也(ye)被廣(guang)泛使(shi)用(yong)。

在許(xu)多(duo)藥物發(fa)現應用(yong)中，使(shi)用(yong)瞬時轉染方(fang)法快(kuai)速篩選(xuan)蛋(dan)白質(zhi)構建(jian)體是有益的(de)，因(yin)為它(ta)可(ke)以同(tong)時評(ping)估各種靶分(fen)子或蛋(dan)白質(zhi)亞(ya)型(xing)。在多數(shu)情(qing)況下(xia)，瞬時轉染是(shi)並(bing)行進(jin)行(xing)的(de)，而更(geng)多(duo)資(zi)源密(mi)集型(xing)的(de)穩定細(xi)胞(bao)系(xi)也(ye)正在開(kai)發(fa)中。

轉染技(ji)術(shu)的(de)使用(yong)穩定的(de)轉染試(shi)劑盒(he) ，可以提高(gao)懸(xuan)浮(fu) CHO 和(he) 293 衍生(sheng)細(xi)胞(bao)中(zhong)的(de)抗體蛋(dan)白滴(di)度。比(bi)如(ru)：使用(yong) Mirus Bio 的(de)技(ji)術(shu)，通過(guo)添(tian)加質(zhi)粒 DNA、Trans IT-PRO 轉染試(shi)劑和(he) PRO Boost 試(shi)劑在無血清(qing)培(pei)養基(ji)中制(zhi)備(bei)轉染復(fu)合物。

 將復(fu)合物孵育(yu) 10-30 分(fen)鐘後，可(ke)以將它(ta)們直(zhi)接添(tian)加到(dao)正常(chang)生(sheng)長(chang)培(pei)養(yang)基(ji)中的(de)細(xi)胞(bao)中(zhong)。使用(yong)快(kuai)速轉染試(shi)劑盒(he)進(jin)行(xing)轉染，無(wu)需在轉染後更(geng)換培(pei)養基(ji)，適(shi)用(yong)於瞬時轉染和(he)穩定轉染。對(dui)於分(fen)泌(mi)型(xing)抗體構建(jian)體，通常(chang)在分(fen)批(pi)發(fa)酵轉染後 5-7 天獲(huo)得(de)Max滴度。

在優(you)化瞬時轉染方(fang)案(an)期(qi)間(jian)應當(dang)考(kao)慮(lv)以下幾個(ge)參(can)數(shu)，主要(yao)包(bao)括(kuo)：轉染時的(de)細(xi)胞(bao)密(mi)度、DNA 濃(nong)度、試(shi)劑與(yu) DNA 的(de)比率(lv)和(he)細(xi)胞(bao)培(pei)養基(ji)。

1.細(xi)胞(bao)密(mi)度

在任何(he)組織培養(yang)實驗(yan)之(zhi)前(qian)，細(xi)胞(bao)健(jian)康是壹個(ge)重(zhong)要的(de)考慮(lv)因(yin)素(su)。理想情(qing)況下(xia)，細(xi)胞(bao)應具(ju)有壹致的(de)倍(bei)增(zeng)時間(jian)和高(gao)活力(li)。細(xi)菌、酵母菌、病毒(du)或支原(yuan)體的(de)汙染不(bu)僅(jin)會損(sun)害(hai)細(xi)胞(bao)健(jian)康，還(hai)會降低轉染效率(lv)。

對(dui)於可(ke)以生(sheng)長(chang)到(dao)較(jiao)高(gao)密度的(de)懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞(bao)，在轉染時優(you)化細(xi)胞(bao)密(mi)度尤(you)其重要。當細(xi)胞(bao)在轉染過(guo)程中(zhong)積(ji)極(ji)分(fen)裂(lie)時效率(lv)為Max值，這有助(zhu)於質(zhi)粒DNA 進(jin)入(ru)細(xi)胞(bao)核(he)。圖 1顯(xian)示(shi)了 CHO 懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞(bao)密(mi)度的(de)滴定，範圍為 0.25 x 10 6 –2.0 x 10 6 個(ge)細(xi)胞(bao)/mL。在轉染時，在 0.5 x 10 6 –1.0 x 10 6 個(ge)細(xi)胞(bao)/mL之(zhi)間的(de)細(xi)胞(bao)密(mi)度下(xia)檢測(ce)到(dao)最(zui)大數(shu)量(liang)的(de) GFP 表(biao)達(da)細(xi)胞(bao)（約(yue) 60%） 。

圖 1. 轉染時的(de)最(zui)佳細(xi)胞(bao)密(mi)度為 0.5 x 10 6 –1.0 x 10 6 個(ge)細(xi)胞(bao)/mL。CHO-S 細(xi)胞(bao)在轉染時使(shi)用(yong)Trans IT-PRO 轉染試(shi)劑盒(he)以壹定範圍的(de)細(xi)胞(bao)密(mi)度轉染。使(shi)用(yong)增(zeng)強(qiang)型(xing)綠(lv)色(se)熒(ying)光蛋(dan)白 (EGFP) 報(bao)告(gao)質(zhi)粒，使用(yong) 1:1:1 比例(li)的(de)反式(shi) IT-PRO:Boost 試(shi)劑:DNA 形成(cheng)復(fu)合物。使(shi)用(yong)流式(shi)細(xi)胞(bao)術(shu)在轉染後 48 小(xiao)時確(que)定 GFP 轉染效率(lv)。使(shi)用(yong)在 FreeStyle CHO 表(biao)達(da)培(pei)養(yang)基(ji)（2 mL/孔）中(zhong)培(pei)養的(de) FreeStyle™ CHO-S 細(xi)胞(bao)在 24 孔深(shen)孔搖(yao)床中進(jin)行(xing)轉染。誤(wu)差(cha)棒(bang)代(dai)表(biao)壹式(shi)三份(fen)孔的(de)標(biao)準偏差(cha)。

2.DNA濃度

在某些(xie)細(xi)胞(bao)類型(xing)中，增(zeng)加(jia)質(zhi)粒 DNA 濃度也(ye)會提升(sheng)轉染效率(lv)，提(ti)高(gao)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)。然(ran)而， DNA 的(de)濃度如(ru)果過高(gao)，會使成(cheng)本增(zeng)加(jia)或者(zhe)產生(sheng)毒(du)性(xing)。圖 2使(shi)用(yong)三種不(bu)同(tong)劑量(liang)的(de)Trans IT-PRO 和 PRO Boost 試(shi)劑檢查(zha)了每(mei)毫升培養物 0.25–3.0 µg 的(de)壹系(xi)列質(zhi)粒 DNA 濃度。通(tong)常(chang)，每(mei)毫升培養物中 1.0–1.5 µg DNA ,是細(xi)胞(bao)表(biao)達(da)的(de)Max濃度。

圖 2. 使(shi)用(yong)Trans IT-PRO 轉染試(shi)劑盒(he)滴定 DNA 濃度和(he)試(shi)劑與(yu) DNA 的(de)比率(lv)。在不(bu)同(tong)的(de)質粒濃度 (0.25–3.0 µg/mL) 和(he)使(shi)用(yong)三種不(bu)同(tong)比例(li)的(de)Trans IT-PRO:PRO Boost Reagent (0.5:0.5、1:1 和 2:2)/µg DNA 比(bi)較(jiao)熒(ying)光素酶蛋(dan)白表(biao)達(da)。使(shi)用(yong)在 BD Select CD1000 培養(yang)基(ji)（2 mL/孔）中(zhong)培(pei)養的(de) FreeStyle CHO-S 細(xi)胞(bao)在 24 孔深(shen)孔搖(yao)床中進(jin)行(xing)轉染。細(xi)胞(bao)以 0.5 x 10 6 個(ge)細(xi)胞(bao)/mL的(de)密度鋪板(ban)，轉染後 48 小(xiao)時收(shou)獲(huo)，並(bing)使用(yong)常(chang)規(gui)熒(ying)光素酶測(ce)定法進(jin)行(xing)測定。誤(wu)差(cha)棒(bang)代(dai)表(biao)壹式(shi)三份(fen)孔的(de)標(biao)準偏差(cha)。

2.試(shi)劑濃(nong)度

試(shi)劑與(yu) DNA 的(de)比率(lv)也(ye)是瞬時轉染中(zhong)影(ying)響細(xi)胞(bao)轉染速(su)度的(de)主要(yao)參(can)數(shu)。如(ru)果試(shi)劑量(liang)不(bu)足或過(guo)量(liang)都(dou)會阻(zu)礙 DNA 遞(di)送。這是由(you)於陽(yang)離(li)子(zi)轉染試(shi)劑和(he)帶負(fu)電(dian)的(de)質粒 DNA 之(zhi)間的(de)靜電(dian)相互(hu)作(zuo)用(yong)促(cu)進(jin)了轉染復(fu)合物的(de)質膜(mo)結合(he)和(he)內化。然(ran)而，過多(duo)的(de)正電(dian)荷通(tong)常(chang)與細(xi)胞(bao)毒(du)性(xing)有關，因(yin)此需要滴定轉染試(shi)劑與(yu) DNA 的(de)比率(lv)以確定峰(feng)值蛋(dan)白質(zhi)的(de)表(biao)達(da)。

圖 2比(bi)較了三種不(bu)同(tong)水平的(de)Trans IT-PRO 和 PRO Boost Reagent（每(mei) µg DNA 0.5 µL–2.0 µL）；使用(yong)濃度為每(mei) 1.0 µg DNA 各 1.0 µL 的(de)Trans IT-PRO 和 PRO Boost 試(shi)劑可(ke)獲得(de)Max的(de)熒(ying)光素酶表(biao)達(da)。

3.培(pei)養(yang)基(ji)試(shi)劑配(pei)方(fang)

轉染效率(lv)受(shou)培養(yang)生(sheng)長(chang)培(pei)養(yang)基(ji)的(de)影(ying)響，並(bing)且(qie)有許(xu)多(duo)市售的(de)無血清(qing)生(sheng)長(chang)培(pei)養(yang)基(ji)用(yong)於生(sheng)物(wu)功(gong)能(neng)型(xing)蛋(dan)白質(zhi)的(de)生(sheng)產。由(you)於這些培養基(ji)配方(fang)是(shi)專(zhuan)有的(de)，因(yin)此可能(neng)需要測試(shi)幾種(zhong)培養(yang)基(ji)配方(fang)以找(zhao)到與(yu)所(suo)需轉染方(fang)法互補的(de)壹種(zhong)。

圖 3顯(xian)示(shi)了懸(xuan)浮(fu) CHO 細(xi)胞(bao)，它(ta)們已(yi)適(shi)應五(wu)種(zhong)不(bu)同(tong)的(de)培養(yang)基(ji)配方(fang)。使(shi)用(yong)多種(zhong)轉染方(fang)法，包括： Trans IT-PRO 轉染試(shi)劑盒(he)、試(shi)劑 P 和(he)試(shi)劑 F（圖 3） ，用(yong)編碼(ma)人(ren) IgG1 抗(kang)體構建(jian)體的(de)質粒轉染適(shi)應相(xiang)應培(pei)養(yang)基(ji)的(de)細(xi)胞(bao)。

在給定的(de)轉染方(fang)法中，分(fen)泌(mi)的(de)抗體滴度變(bian)化超過 10 倍(bei)，具(ju)體取決於培(pei)養(yang)基(ji)類型(xing)。此外(wai)，並(bing)非所(suo)有轉染技(ji)術(shu)都表(biao)現出(chu)廣(guang)譜(pu)培養基(ji)兼(jian)容(rong)性(xing)。

懸(xuan)浮(fu) CHO 衍生(sheng)細(xi)胞(bao)的(de)瞬時轉染效率(lv)直(zhi)接關系(xi)到靶向藥(yao)物的(de)研發(fa)和生(sheng)產。值(zhi)得(de)註意的(de)是，蛋(dan)白質(zhi)產量(liang)嚴重(zhong)依(yi)賴(lai)於重(zhong)組蛋(dan)白質(zhi)的(de)內在特性(xing)。相同(tong)亞(ya)型(xing)的(de)兩種(zhong)抗(kang)體構建(jian)體可以產生(sheng)截(jie)然(ran)不(bu)同(tong)的(de)蛋(dan)白質(zhi)滴度。比(bi)較(jiao)兩(liang)種或多(duo)種(zhong)轉染方(fang)法時，請(qing)在同(tong)壹天使(shi)用(yong)相同(tong)的(de)質粒 DNA 構建(jian)體和相同(tong)批(pi)次的(de)細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)轉染。這允許(xu)小(xiao)化細(xi)胞(bao)和(he)實驗(yan)變(bian)量(liang)。

Trans IT-PRO 轉染試(shi)劑盒(he)等(deng)新(xin)轉染方(fang)法使研究人(ren)員(yuan)能夠(gou)以直接壹致的(de)方(fang)式(shi)獲得(de)更(geng)高(gao)的(de)蛋(dan)白質(zhi)滴度。關鍵轉染參(can)數(shu)的(de)進(jin)壹步優(you)化使研究人(ren)員(yuan)能夠(gou)獲(huo)得高(gao)轉染效率(lv)和(he)足夠的(de)蛋(dan)白質(zhi)產量(liang)，以加速藥物發(fa)現。

圖 3. 蛋(dan)白質(zhi)產量(liang)取(qu)決(jue)於培(pei)養(yang)基(ji)配方(fang)和(he)轉染方(fang)法。FreeStyle CHO-S 細(xi)胞(bao)適(shi)應五(wu)種(zhong)代(dai)表(biao)性(xing)生(sheng)長(chang)培(pei)養(yang)基(ji)。使用(yong)Trans IT-PRO 和 PRO Boost Reagent (1:1:1)、Reagent P (4:1) 或 Reagent F (1:1) 轉染試(shi)劑轉染細(xi)胞(bao)。在 24 孔深(shen)孔搖(yao)床塊中(zhong)進(jin)行(xing)轉染，每(mei)毫升培養物中使用(yong) 1 µg DNA，轉染時使(shi)用(yong) 0.5 x 10 6 個(ge)細(xi)胞(bao)/mL。從(cong)第 5 天澄清(qing)的(de)上清(qing)液(ye)對人(ren) IgG1 進(jin)行(xing)定量(liang)，並(bing)通過(guo)標(biao)準夾心(xin) ELISA 進(jin)行(xing)分(fen)析(xi)。誤(wu)差(cha)棒(bang)代(dai)表(biao)壹式(shi)三份(fen)孔的(de)

蘇州(zhou)阿爾法生(sheng)物(wu)實驗(yan)器(qi)材有限(xian)公司(si)14年(nian)專(zhuan)註於生(sheng)物(wu)實驗(yan)室(shi)儀(yi)器(qi)設(she)備(bei)及實驗(yan)試(shi)劑耗材的(de)供應商(shang)，主(zhu)要供(gong)應的(de)生(sheng)物(wu)試(shi)劑包(bao)括 瞬時轉染、穩定轉染、細(xi)胞(bao)轉染試(shi)劑、轉染試(shi)劑盒(he)、天根(gen)試(shi)劑盒(he)、碧雲(yun)天試(shi)劑等(deng)細(xi)胞(bao)學(xue)、分(fen)子生(sheng)物(wu)學(xue)、生(sheng)命(ming)科(ke)學(xue)相(xiang)關的(de)試(shi)劑及耗材，另外(wai)提(ti)供生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)、發(fa)酵罐(guan)、振(zhen)蕩培養(yang)箱(xiang)、移液(ye)器、離心機、顯微鏡(jing)、純(chun)水(shui)機等(deng)實驗(yan)室(shi)設備(bei)。