細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)分(fen)離方法

標簽：外(wai)泌(mi)體(ti) 離心分(fen)離 外(wai)泌(mi)體(ti)分(fen)離 高(gao)速離心機(ji) 細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)

     在(zai)生物(wu)流體(ti)中發(fa)現的細(xi)胞(bao)外(wai)囊(nang)泡包(bao)括(kuo)來(lai)自(zi)內體(ti)，多泡體(ti)的細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)（30 nm 至 150 nm）和來自(zi)質(zhi)膜(mo)的微泡(pao)（150 nm 至 1000 nm）。目前已知有多(duo)種從生(sheng)物(wu)體(ti)液中分(fen)離外(wai)泌(mi)體(ti)的方法出了(le)使用(yong)高(gao)速離心機(ji)的離心分(fen)離法以(yi)外(wai)，還(hai)有色譜法、超濾(lv)過(guo)濾(lv)法、基於(yu)聚(ju)合(he)物(wu)的沈澱(dian)和免疫分(fen)離法等。

       這(zhe)些(xie)細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)分(fen)離方法提取(qu)的外(wai)泌(mi)體(ti)要(yao)警惕非外(wai)泌(mi)體(ti)顆粒(li)汙染(ran)，如(ru)雕(diao)亡(wang)小體(ti)、雕(diao)亡(wang)小囊(nang)泡、外(wai)泌(mi)體(ti)和脂(zhi)蛋(dan)白(bai)，均(jun)會(hui)對(dui)獲得的外(wai)泌(mi)體(ti)生物(wu)活(huo)性產(chan)生(sheng)影(ying)響。另外(wai)，分(fen)離方法也會(hui)影(ying)響細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)的純(chun)度(du)和產量(liang)。如(ru)果要(yao)從培(pei)養(yang)基中(zhong)分(fen)離外(wai)泌(mi)體(ti)，就要(yao)使用(yong)無(wu)血清培(pei)養(yang)基或(huo)無(wu)外(wai)泌(mi)體(ti)胎牛血清。

外(wai)泌(mi)體(ti)分(fen)離方法優缺(que)點對比：

表 1。外(wai)泌(mi)體(ti)分(fen)離方法比較。

差速離心法：

差速離心法仍(reng)是實(shi)驗(yan)中(zhong)常(chang)用(yong)的外(wai)泌(mi)體(ti)分(fen)離技術。

主要(yao)步(bu)驟如(ru)下：

1.使用(yong)離心機(ji)低速離心來去(qu)除(chu)細(xi)胞(bao)與(yu)細(xi)胞(bao)碎(sui)片

2.而後(hou)增加(jia)轉(zhuan)速通過(guo)離心來消除(chu)樣(yang)本中較大(da)的細(xi)胞(bao)囊(nang)泡

3.再使用(yong)高(gao)速離心機(ji)進行高(gao)速離心，通過(guo)離心沈澱(dian)的方式提取(qu)外(wai)泌(mi)體(ti)。

在(zai)這裏(li)，需要(yao)註意(yi)的是生(sheng)物(wu)流體(ti)的粘度與(yu)分(fen)離的外(wai)泌(mi)體(ti)的純(chun)度(du)有較強的相關性(xing)。

所(suo)以(yi)，對於(yu)高(gao)粘度(du)的生物(wu)樣(yang)品(pin)需要(yao)超速離心機(ji)進行較(jiao)長時(shi)間(jian)的離心操作(zuo)。

圖(tu) 1.差速離心法。

密度(du)梯(ti)度離心法

    這種(zhong)方法將(jiang)超速離心機(ji)的超速離心與(yu)蔗(zhe)糖密度(du)梯(ti)度相結合 。具體(ti)地說，密(mi)度梯度(du)離心用(yong)於(yu)將(jiang)外(wai)泌(mi)體(ti)與(yu)非囊(nang)泡顆粒(li)（例(li)如(ru)蛋白(bai)質(zhi)和蛋白(bai)質(zhi)/RNA 聚(ju)集(ji)體(ti)）分(fen)離。因(yin)此，該(gai)方法將(jiang)囊(nang)泡與(yu)不(bu)同密度的顆粒(li)分(fen)離。足夠(gou)的離心時間(jian)比較重(zhong)要(yao)，否(fou)則(ze)如(ru)果外(wai)泌(mi)體(ti)部分(fen)具有(you)相似的密度，則(ze)仍(reng)可能在(zai)外(wai)泌(mi)體(ti)部分(fen)中發(fa)現汙(wu)染顆粒(li)。

圖(tu) 2.用(yong)於(yu)分(fen)離外(wai)泌(mi)體(ti)的纖毛多(duo)孔結構。該(gai)結構不(bu)會(hui)讓大(da)於(yu) 1 μm 的細(xi)胞(bao)和其他(ta)顆粒(li)進入布線(xian)區(qu)域。壹(yi)些(xie)較(jiao)小的顆粒(li)和細(xi)胞(bao)碎(sui)片可以(yi)進入微柱(zhu)區(qu)域，但(dan)被納(na)米(mi)纖毛排(pai)除(chu)，形成直徑(jing)為 30-200 nm 的孔。纖毛結構選(xuan)擇(ze)性地(di)捕獲外(wai)泌(mi)體(ti)和小細(xi)胞(bao)外(wai)囊(nang)泡。

尺寸(cun)排(pai)阻(zu)色譜分(fen)離法

      尺寸(cun)排(pai)阻(zu)色譜 (SEC) 用(yong)於(yu)根據尺寸(cun)而非分(fen)子量(liang)分(fen)離大(da)分(fen)子。該(gai)技術應(ying)用(yong)了(le)壹種(zhong)填(tian)充(chong)有(you)多孔聚(ju)合(he)物(wu)珠(zhu)子(zi)的柱子，該(gai)珠(zhu)子(zi)含有多(duo)個孔和隧道(dao)。分(fen)子根(gen)據它(ta)們(men)的直徑(jing)穿(chuan)過(guo)珠(zhu)子(zi)。小(xiao)半徑(jing)分(fen)子通過(guo)色譜柱的孔遷移(yi)需(xu)要(yao)更長的時間(jian)，而大(da)分(fen)子從(cong)色譜柱中(zhong)洗脫(tuo)得較早。尺寸(cun)排(pai)阻(zu)色譜可以(yi)精(jing)確分(fen)離大(da)分(fen)子和小分(fen)子。此(ci)外(wai)，該(gai)方法可以(yi)應(ying)用(yong)不同(tong)的洗脫(tuo)溶(rong)液。與(yu)離心機(ji)離心方法相比，色譜分(fen)離具有(you)較多(duo)的優勢，因(yin)為通過(guo)色譜分(fen)離的外(wai)泌(mi)體(ti)不受剪(jian)切力的影響，避免了(le)因(yin)剪(jian)切力所(suo)造(zao)成(cheng)的囊(nang)泡結構改(gai)變。目(mu)前，SEC 是壹(yi)種廣(guang)泛接受(shou)的分(fen)離血液和尿液中存在(zai)的外(wai)泌(mi)體(ti)的技術。

    此(ci)外(wai)，SEC 方法與(yu)超(chao)濾(lv)相結合已(yi)用(yong)於(yu)分(fen)離和分(fen)析(xi)尿源(yuan)性(xing)外(wai)泌(mi)體(ti)。此外(wai)，流(liu)場(chang)-流分(fen)餾結合紫外(wai)分(fen)析(xi)儀(yi)和光(guang)散射(she)檢(jian)測器(qi)已(yi)被應(ying)用(yong)於(yu)分(fen)析(xi)外(wai)泌(mi)體(ti)的大(da)小和純(chun)度(du)。流場(chang)-流分(fen)餾結合拋物(wu)線(xian)和交叉(cha)流來(lai)分(fen)離外(wai)泌(mi)體(ti)。獲得的外(wai)泌(mi)體(ti)已通過(guo)電子(zi)顯(xian)微鏡(jing)和質(zhi)譜檢(jian)測。

過(guo)濾(lv)法

     超濾(lv)膜(mo)也(ye)可用(yong)於(yu)外(wai)泌(mi)體(ti)的分(fen)離。根據微泡(pao)的大(da)小，使(shi)用(yong)超濾(lv)膜(mo)過(guo)濾(lv)的方法可以(yi)將(jiang)外(wai)泌(mi)體(ti)與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)和其他(ta)大(da)分(fen)子分(fen)離。外(wai)泌(mi)體(ti)也可以(yi)通過(guo)多孔結構捕獲它(ta)們(men)來分(fen)離（圖(tu) 2）。常(chang)見(jian)的過(guo)濾(lv)膜(mo)孔徑(jing)為 0.8 µm、0.45 µm 或(huo) 0.22 µm，可用(yong)於(yu)收(shou)集(ji)大(da)於(yu) 800 nm、400 nm 或(huo) 200 nm 的外(wai)泌(mi)體(ti)。比如(ru)微柱(zhu)多孔矽纖毛結構壹(yi)般(ban)用(yong)於(yu)分(fen)離 40-100 nm 外(wai)泌(mi)體(ti)。在(zai)初(chu)始(shi)步(bu)驟中(zhong)，去(qu)除(chu)較大(da)的囊(nang)泡。在(zai)接下來的步(bu)驟中(zhong)，外(wai)泌(mi)體(ti)會群集中(zhong)在(zai)過(guo)濾(lv)膜(mo)上(shang)。隔(ge)離步(bu)驟相對(dui)較短(duan)，但(dan)該(gai)方法需要(yao)用(yong) PBS 緩(huan)沖液對矽(gui)結構進行預(yu)孵育(yu)。

除(chu)標準(zhun)過(guo)濾(lv)技術外(wai)，切(qie)向(xiang)流(liu)過(guo)濾(lv)在(zai)有效(xiao)分(fen)離外(wai)泌(mi)體(ti)方面也有著(zhe)嘗(chang)試應(ying)用(yong)，通過(guo)切向(xiang)流(liu)過(guo)濾(lv)技術去(qu)除(chu)遊(you)離肽(tai)和其他(ta)小化合(he)物(wu)從而分(fen)離具有(you)確定(ding)大(da)小的外(wai)泌(mi)體(ti)。此外(wai)，在(zai)體(ti)外(wai)研(yan)究和脂(zhi)肪組(zu)織中，也會采用(yong)超濾(lv)與(yu) SEC 的結合的方式來分(fen)離外(wai)泌(mi)體(ti)。

圖(tu) 3.外(wai)泌(mi)體(ti)過(guo)濾(lv)的篩分(fen)模型(xing)。通過(guo) (a) 對片上(shang)過(guo)濾(lv)器(qi)施(shi)加(jia)壓(ya)力或(huo) (b) 產(chan)生電(dian)場(chang)，迫使外(wai)泌(mi)體(ti)穿(chuan)過(guo)多孔膜(mo)，結合錯流和電泳分(fen)選 [來(lai)完成(cheng)篩分(fen)。

基於(yu)聚(ju)合(he)物(wu)的沈澱(dian)法

     基於(yu)聚(ju)合(he)物(wu)的沈澱(dian)技術通常(chang)包(bao)括(kuo)將(jiang)生物(wu)流體(ti)與(yu)含聚(ju)合(he)物(wu)的沈澱(dian)溶(rong)液混合(he)、4℃孵(fu)育(yu)和低速離心。用(yong)於(yu)基於(yu)聚(ju)合(he)物(wu)的沈澱(dian)的較常(chang)見(jian)聚(ju)合(he)物(wu)之(zhi)壹是聚(ju)乙(yi)二(er)醇 (PEG)。這(zhe)種(zhong)聚(ju)合(he)物(wu)的沈澱(dian)可以(yi)對分(fen)離的外(wai)泌(mi)體(ti)產生溫和影響(xiang)而且可以(yi)產生(sheng)中(zhong)性的 pH 值。由此，出現了(le)幾種(zhong)常(chang)見(jian)的外(wai)泌(mi)體(ti)試劑(ji)盒：比如(ru)： System Biosciences, Mountain View, CA,  ExoQuick™ 等。

研究表(biao)明(ming)，使用(yong) ExoQuick™ 方法可以(yi)快速執行，無(wu)需額外(wai)設(she)備(bei)，只需用(yong)高(gao)速離心機(ji)進行超(chao)速離心可以(yi)獲得高(gao)產量(liang)的外(wai)泌(mi)體(ti)。但(dan)是此(ci)方法的缺點是：非外(wai)泌(mi)體(ti)材(cai)料(liao)對(dui)外(wai)泌(mi)體(ti)分(fen)離物(wu)的汙染仍(reng)然(ran)是基(ji)於(yu)聚(ju)合(he)物(wu)的分(fen)離方法的壹個問題(ti)。此外(wai)，分(fen)離物(wu)中的聚(ju)合(he)物(wu)可能會幹(gan)擾下遊(you)分(fen)析(xi)。

免疫分(fen)離法：

 免疫芯片方法基於(yu)表面外(wai)泌(mi)體(ti)受體(ti)，用(yong)於(yu)根據來源(yuan)分(fen)離外(wai)泌(mi)體(ti)。獲得的外(wai)泌(mi)體(ti)可直接(jie)分(fen)析(xi)或(huo)用(yong)於(yu) DNA 或(huo)總(zong) RNA 分(fen)離 。外(wai)泌(mi)體(ti)胞(bao)內蛋白(bai)可用(yong)作(zuo)分(fen)離外(wai)泌(mi)體(ti)的特(te)異(yi)性標誌(zhi)物(wu)。此外(wai)，基(ji)於(yu) ELISA 的 ExoTEST™ 也可以(yi)用(yong)於(yu)有效分(fen)離外(wai)泌(mi)體(ti)。其原理是：使(shi)用(yong)塗有外(wai)泌(mi)體(ti)抗(kang)體(ti)的ExoTEST™ 板，可以(yi)從各(ge)種(zhong)生物(wu)體(ti)液中分(fen)離出外(wai)泌(mi)體(ti)。該(gai)方法適(shi)用(yong)於(yu)常(chang)見(jian)和細(xi)胞(bao)類(lei)型(xing)特(te)異(yi)性外(wai)泌(mi)體(ti)蛋白(bai)的檢(jian)測、分(fen)析(xi)和定(ding)量(liang)。

篩(shai)分(fen)分(fen)離法:

 該(gai)技術是通過(guo)膜(mo)從(cong)生物(wu)液體(ti)中篩分(fen)外(wai)泌(mi)體(ti)並(bing)通過(guo)壓(ya)力或(huo)電(dian)泳進行過(guo)濾(lv)來分(fen)離外(wai)泌(mi)體(ti) （圖(tu) 3）。篩分(fen)分(fen)離法的分(fen)離時間(jian)較短(duan)，但(dan)分(fen)離的外(wai)泌(mi)體(ti)純(chun)度(du)卻處於(yu)較高(gao)的水(shui)平(ping)。篩(shai)分(fen)分(fen)離法的缺點在(zai)於(yu)分(fen)離的外(wai)泌(mi)體(ti)回(hui)收(shou)率(lv)較(jiao)低。

         總(zong)之(zhi)，細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)提取、外(wai)泌(mi)體(ti)分(fen)離在(zai)腫瘤(liu)等(deng)研(yan)究領(ling)域(yu)發(fa)揮著(zhe)重(zhong)要(yao)作(zuo)用(yong)。細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)分(fen)離方法目前(qian)多(duo)數(shu)還(hai)是采(cai)用(yong)高(gao)速離心機(ji) 進行離心分(fen)離的技術方法，然(ran)而，其他(ta)幾種(zhong)分(fen)離技術，如(ru)過(guo)濾(lv)法、免疫分(fen)離法和篩分(fen)法，雖然(ran)也能進行外(wai)泌(mi)體(ti)分(fen)離，但(dan)每(mei)種方法都有其局(ju)限(xian)性，多(duo)數(shu)還(hai)是僅(jin)應(ying)用(yong)於(yu)實(shi)驗(yan)室(shi)、科(ke)學研(yan)究等(deng)領(ling)域。

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