PCR擴(kuo)增(zeng)儀(yi)的原(yuan)理及擴(kuo)增(zeng)實(shi)驗中(zhong)存(cun)在(zai)的問(wen)題(ti)

標簽(qian)：pcr擴(kuo)增(zeng) 熒光(guang)定量(liang)pcr  定量pcr  pcr儀(yi) pcr實(shi)驗室(shi)  PCR擴(kuo)增(zeng)儀(yi) 基因(yin)擴(kuo)增(zeng)儀(yi)

PCR檢(jian)測方法有很(hen)多，其(qi)中(zhong)PCR擴(kuo)增(zeng)儀(yi)又(you)稱為“PCR儀(yi)"，它(ta)是PCR實(shi)驗中(zhong)*的實(shi)驗室(shi)設備(bei)之壹(yi)。PCR儀(yi)器大致(zhi)可以分(fen)為(wei)三類：即(ji)：普通(tong)PCR儀(yi)，熒(ying)光定(ding)量PCR儀(yi)，梯(ti)度PCR儀(yi)和(he)原(yuan)位(wei)PCR儀(yi)等(deng)。 

壹(yi)、PCR的原(yuan)理 

在(zai)pcr擴(kuo)增(zeng)實(shi)驗中(zhong)，PCR反應過(guo)程(cheng)實(shi)質就是DNA按(an)模板復制而(er)發(fa)生(sheng)的聚合酶鏈(lian)反應(ying)的過(guo)程(cheng)，主要包括(kuo)引(yin)物、dNTP、DNA靶序(xu)列、DNA聚合及PH緩(huan)沖(chong)液體(ti)系。

PCR反應(ying)過(guo)程(cheng)如(ru)下：

1.通(tong)過(guo)升(sheng)溫反應體(ti)系混(hun)合物壹(yi)般為：94℃/15s-30s.使(shi)目標(biao)DNA雙(shuang)螺(luo)旋的氫鍵(jian)產(chan)生(sheng)斷(duan)裂(lie)從(cong)而(er)形成(cheng)單(dan)鏈(lian)DNA作(zuo)為合成(cheng)模板.

2、在(zai)反(fan)應(ying)體(ti)系冷(leng)卻至(zhi)引(yin)物的TM值(zhi)左(zuo)右，使(shi)引(yin)物與單鏈(lian)DNA模板產(chan)生(sheng)互補(bu)結(jie)合，從而(er)實(shi)現DNA的互補(bu)擴(kuo)增(zeng)，這壹(yi)過(guo)程(cheng)也(ye)被(bei)稱之為(wei)退(tui)火。

3、擴(kuo)增(zeng)延伸(shen)

在(zai)PCR擴(kuo)增(zeng)過(guo)程(cheng)中，當反(fan)應體(ti)系的溫度升(sheng)高(gao)到72 ℃左(zuo)右時(shi)，引(yin)物在(zai)TAQ聚合酶的作(zuo)用下，以引(yin)物為起點(dian)dNTP作(zuo)為底(di)物合成(cheng)新(xin)的DNA鏈條(tiao)。

 以(yi)上步驟重(zhong)復循環，直擴(kuo)增(zeng)量達(da)到基因(yin)檢(jian)測的所(suo)需要數(shu)量(liang)即(ji)可停(ting)止循環。

使用(yong)PCR擴(kuo)增(zeng)儀(yi)進(jin)行(xing)PCR反應(ying)過(guo)程(cheng)中常見(jian)的問(wen)題(ti)：

無(wu)明顯的擴(kuo)增(zeng)條(tiao)帶(dai)

這種(zhong)情況主(zhu)要是由(you)於以下情況產(chan)生(sheng)： 

（1）Taq酶失活(huo)或(huo)Taq酶活(huo)性(xing)加入量(liang)少(shao)所(suo)造成(cheng)。DNA聚合Taq酶的保存(cun)溫度壹般在(zai)-20℃環境(jing)下，盡量(liang)避(bi)免反(fan)復凍融(rong)所(suo)產(chan)生(sheng)的影響(xiang)。

（2）混合模板反應(ying)體(ti)系中(zhong)如(ru)果(guo)含(han)有甲(jia)酸、甲(jia)醛含(han)等(deng)雜質也(ye)會對(dui)DNA鏈(lian)上的堿基造(zao)成(cheng)影(ying)響(xiang)，降低(di)PCR擴(kuo)增(zeng)效果(guo)。

（3）PCR儀(yi)的各(ge)反(fan)應(ying)階段(duan)適(shi)宜(yi)溫度設定也(ye)很重(zhong)要，過(guo)高(gao)或(huo)過(guo)低(di)的反應(ying)溫度，都會使DNA聚合酶產(chan)生(sheng)失活(huo)。

（4）引(yin)物設置(zhi)不(bu)合理或(huo)反應系(xi)統(tong)中(zhong)被(bei)蛋(dan)白(bai)酶(mei)及核(he)酸酶(mei)，這些(xie)因(yin)素(su)也(ye)同樣(yang)會影(ying)響(xiang)到DNA的合成(cheng)與產(chan)出(chu)。

 （5）另(ling)外，PCR循環數不(bu)足或(huo)者(zhe)延(yan)伸(shen)擴(kuo)增(zeng)時(shi)間短(duan)也(ye)會影(ying)響(xiang)到PCR產(chan)物(wu)產(chan)量(liang)。

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