細(xi)胞培(pei)養過(guo)程(cheng)中的常(chang)見(jian)問(wen)題(ti)及解決方案

標(biao)簽(qian)：細胞(bao) 細(xi)胞培(pei)養(yang) 液氮 培養基 

細(xi)胞培養(yang)是(shi)生(sheng)命(ming)科(ke)學(xue)實驗中的基(ji)礎(chu)實(shi)驗(yan)，在(zai)細(xi)胞生(sheng)長過(guo)程(cheng)中，很多(duo)因(yin)素(su)都會(hui)造成細胞(bao)生(sheng)長不良。下面簡單歸(gui)納壹下(xia)細(xi)胞(bao)生(sheng)長不良的原(yuan)因(yin)及對應的(de)解(jie)決方案。 

常(chang)見(jian)問(wen)題(ti)壹(yi)：為(wei)什麽(me)細(xi)胞(bao)解(jie)凍後缺少活力(li)，活細(xi)胞占(zhan)比(bi)較(jiao)低(di)？

這種(zhong)現(xian)象可能(neng)主要由以下(xia)幾種原(yuan)因(yin)所(suo)導致：

1.培養(yang)物凍存(cun)液(ye)等質(zhi)量欠缺。

解決方案：

a.確(que)保用(yong)來(lai)制備儲存(cun)物（凍存(cun)液(ye)）的起始培(pei)養(yang)物需要保證(zheng)其(qi)健康(kang)、無(wu)微(wei)生(sheng)物汙(wu)染(ran)、處於生(sheng)長對數期後期狀態(tai)。

b.收(shou)獲細(xi)胞時(shi)需要小心翼(yi)翼，避(bi)免(mian)細胞(bao)損傷(shang)。 

2.儲存(cun)物凍存(cun)方法不當

解(jie)決方案：

a.在(zai)液(ye)氮冷凍細(xi)胞(bao)時(shi)，確保細(xi)胞(bao)、培(pei)養基和其(qi)他(ta)試劑的(de)濃度(du)，以及凍存(cun)實(shi)驗步(bu)驟(zhou)依照(zhao)供應商的(de)建(jian)議(yi)。壹般(ban)來(lai)說，凍存(cun)應該緩慢，大約(yue)1-3° C/min以減(jian)少(shao)冰晶形(xing)成。

b.使(shi)用(yong)電(dian)子可編(bian)程(cheng)或(huo)機(ji)械(xie)冷凍裝置(zhi)以確(que)保壹(yi)致的、適(shi)當速(su)率(lv)的(de)冷凍。

c.選擇(ze)最合適的(de)細(xi)胞冷凍保護(hu)劑。如(ru)果使(shi)用(yong)甘(gan)油(you)，不要將其(qi)存(cun)儲在(zai)光(guang)照(zhao)下，因(yin)為(wei)曝光(guang)會使(shi)甘(gan)油(you)轉化為(wei)有對細胞(bao)毒性(xing)的(de)物質。

3.儲存(cun)物保存(cun)不當 

解(jie)決方案：

a.儲(chu)存物應時(shi)刻保持在(zai)-130℃，理想情況(kuang)是(shi)置(zhi)於(yu)液(ye)氮(dan)中，以確(que)保較(jiao)大的(de)細(xi)胞(bao)活性(xing)。

b.如(ru)果將細胞直接浸入液(ye)氮(dan)中，容易造成液(ye)氮(dan)泄(xie)露到(dao)凍存(cun)管(guan)內，解凍時(shi)會有凍存(cun)管(guan)爆(bao)炸(zha)的(de)風險。所(suo)以壹(yi)般(ban)儲(chu)存(cun)在(zai)液(ye)氮上(shang)方的氣相(xiang)環(huan)境中。 

4.細胞(bao)解凍方法不當 

解(jie)決方案：

a.壹(yi)般(ban)來(lai)說，細(xi)胞(bao)應該快速(su)解(jie)凍、使(shi)用(yong)預熱的培(pei)養基(ji)、盡(jin)快(kuai)移除(chu)含(han)有冷凍保護(hu)劑的(de)培養(yang)基防(fang)止細(xi)胞活力(li)下(xia)降(jiang)。

b.確(que)保小心操(cao)作(zuo)細胞。不要渦(wo)旋(xuan)或(huo)高(gao)速(su)離心，因(yin)為(wei)低溫(wen)保存(cun)後的特(te)別容易受(shou)到(dao)損傷。

常(chang)見(jian)問(wen)題(ti)二(er)：細胞進(jin)行(xing)解(jie)凍或(huo)傳代後細胞(bao)的附(fu)著(zhe)力(li)偏(pian)低?

這種(zhong)情況(kuang)主要是因為(wei)濕度(du)過(guo)低(di)致使(shi)培養(yang)容器(qi)上(shang)集聚靜電(dian)所(suo)致。

可以通(tong)過(guo)適(shi)當增加房(fang)間(jian)濕度(du)，使(shi)用(yong)防(fang)靜電(dian)裝置(zhi)或(huo)者(zhe)用(yong)消(xiao)毒過(guo)的(de)濕(shi)毛(mao)巾擦拭(shi)培(pei)養容(rong)器外(wai)側(ce)，來減(jian)低靜電(dian)產(chan)生(sheng)。另外(wai)試劑混(hun)合不均(jun)勻，培養瓶轉速(su)等(deng)因(yin)素(su)也(ye)可導致此(ci)現象(xiang)發生(sheng)。所(suo)以在(zai)進(jin)行(xing)細胞培(pei)養(yang)時(shi)，要確保細(xi)胞(bao)和所(suo)有試劑的(de)溶液(ye)混(hun)合充分(fen)。在(zai)使(shi)用(yong)振蕩(dang)培(pei)養(yang)箱進(jin)行(xing)細胞培(pei)養(yang)時(shi)，註(zhu)意設(she)置(zhi)適(shi)宜(yi)的(de)轉速(su)。

常(chang)見(jian)問(wen)題(ti)三：為(wei)什麽(me)細(xi)胞(bao)生(sheng)長速(su)度(du)緩慢？

細(xi)胞生(sheng)長過(guo)慢(man)有很多(duo)原(yuan)因(yin)，其(qi)主要原(yuan)因(yin)如(ru)下(xia)：

1.細(xi)胞(bao)的傳代次(ci)數太(tai)多(duo)，所(suo)以獲(huo)得壹個新的、亞培養次(ci)數較(jiao)少(shao)的(de)細(xi)胞儲存液很有必要。

2.未(wei)選(xuan)擇合適的(de)細(xi)胞收(shou)獲時(shi)機(ji)。

在(zai)使(shi)用(yong)新的細(xi)胞(bao)儲存液(ye)的(de)同時(shi)，也(ye)要把我好適宜的細胞(bao)收(shou)獲時(shi)機(ji)，壹(yi)般(ban)在(zai)對數生(sheng)長期的後期是細(xi)胞收(shou)獲時(shi)間當細(xi)胞(bao)達到*融合後，由於(yu)生(sheng)長過(guo)於(yu)擁擠(ji)，會(hui)逐(zhu)漸(jian)進(jin)入緩慢生(sheng)長階(jie)段，此(ci)時(shi)，細胞的活躍(yue)度也(ye)會隨(sui)之下(xia)降(jiang)。

培(pei)養(yang)基(ji)、血清、緩沖液(ye)等質(zhi)量(liang)差(cha)，或(huo)者(zhe)配(pei)方不合理。培(pei)養(yang)基、血清等(deng)培養(yang)物質是(shi)細(xi)胞生(sheng)長的主要營(ying)養來源(yuan)，所(suo)以其(qi)質(zhi)量直接會影(ying)響(xiang)到(dao)細(xi)胞(bao)的(de)生(sheng)長狀態(tai)。所(suo)以高(gao)質(zhi)量(liang)的培養基(ji)及合理的(de)試(shi)劑配(pei)方維持細(xi)胞的(de)良好生(sheng)長具有決定的作(zuo)用(yong)。

3.CO2濃(nong)度與(yu)緩沖系(xi)統需(xu)求(qiu)不匹(pi)配(pei)，導致pH控制(zhi)不足。

壹般(ban)來(lai)說，細(xi)胞(bao)培(pei)養液中緩沖液(ye)中NaHCO3的濃(nong)度與(yu)CO2濃(nong)度成正比(bi)例(li)關系(xi)。緩沖液(ye)中NaHCO3 的濃(nong)度高(gao)，所(suo)需(xu)求(qiu)的CO2濃度也(ye)較(jiao)高(gao)；這樣(yang)才(cai)能達到PH平(ping)衡(heng)。

4.微生(sheng)物汙(wu)染(ran)，尤其(qi)是(shi)支原(yuan)體(ti)

及時(shi)檢查(zha)汙(wu)染(ran)，防止微生(sheng)物汙(wu)染(ran)，做(zuo)好支原(yuan)體(ti)、器皿(min)、環境消毒、支原(yuan)體(ti)清除(chu)等(deng)工(gong)作(zuo)。

5.培(pei)養(yang)物光敏降(jiang)解(jie)產(chan)生(sheng)細胞(bao)毒性(xing)物質。

如(ru)果培養基長時(shi)間暴露於(yu)熒(ying)光(guang)將會導致光敏感培(pei)養(yang)基組(zu)分轉化成細胞(bao)毒性(xing)自(zi)由基(ji)和H2O2，從而影(ying)響(xiang)到(dao)細(xi)胞(bao)生(sheng)長甚(shen)至(zhi)細(xi)胞(bao)雕亡。所(suo)以平(ping)時(shi)要在(zai)暗(an)處保存(cun)細(xi)胞(bao)核培養(yang)基，避(bi)免(mian)熒(ying)光(guang)暴露。

6.不精(jing)確(que)的細胞計(ji)數方法將(jiang)導致細胞(bao)生(sheng)長不良

a.確保計(ji)數樣(yang)本(ben)充分(fen)混(hun)合，避(bi)免(mian)局部(bu)細(xi)胞(bao)密(mi)度差(cha)異影(ying)響(xiang)精(jing)確(que)計數

b.再(zai)次(ci)檢(jian)查(zha)使(shi)用(yong)血球計(ji)數板進(jin)行(xing)細胞計(ji)數的(de)所(suo)有運(yun)算

常(chang)見(jian)問(wen)題(ti)四：為(wei)什麽(me)細(xi)胞生(sheng)長會不均(jun)勻？

1.細胞或(huo)培(pei)養(yang)基(ji)的混(hun)合不充分(fen)：在(zai)培(pei)養基中接入細(xi)胞(bao)後應當輕(qing)搖(yao)混(hun)勻，在(zai)進(jin)入振蕩(dang)培(pei)養(yang)箱後，保證(zheng)持續(xu)穩定的振幅(fu)頻(pin)率，避(bi)免(mian)局部(bu)濃(nong)度(du)差(cha)異。

2.在(zai)細(xi)胞培養過(guo)程(cheng)中有時(shi)候會(hui)出(chu)現同壹(yi)時(shi)期相(xiang)同器(qi)皿(min)之間細(xi)胞(bao)生(sheng)長不平(ping)衡(heng)。

這種(zhong)情況(kuang)可能(neng)是(shi)由於(yu)培養(yang)箱內(nei)部(bu)的(de)溫(wen)度(du)不均(jun)壹(yi)所(suo)導致。註(zhu)意做(zuo)好以下(xia)兩點(dian)：

a.避(bi)免(mian)將培(pei)養器(qi)皿(min)疊放(fang)，因(yin)為(wei)底部(bu)的(de)培(pei)養(yang)器皿(min)靠近金(jin)屬(shu)架(jia)可能(neng)加熱快。

b.如(ru)果放(fang)在(zai)培(pei)養箱前(qian)部(bu)的(de)培(pei)養(yang)器皿(min)比(bi)後面的生(sheng)長慢，要註(zhu)意保持培(pei)養箱的(de)門(men)盡(jin)可能(neng)關嚴(yan)，並(bing)將前(qian)面的培(pei)養(yang)器皿(min)移到(dao)後面。

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