蛋(dan)白(bai)質免(mian)疫印(yin)跡(ji)實驗(yan)中條(tiao)帶過(guo)多(duo)怎(zen)麽(me)辦(ban)？

標(biao)簽：免(mian)疫印(yin)跡(ji) 蛋白(bai)質 科(ke)普(pu) 抗體  蛋白(bai)質(zhi)免(mian)疫印(yin)跡(ji)
    蛋白(bai)質免(mian)疫印(yin)跡(ji)是(shi)檢(jian)測(ce)復雜(za)混(hun)合物中蛋白(bai)質(zhi)抗原的(de)常(chang)用技(ji)術。通過(guo) SDS-聚(ju)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)凝膠(jiao)電(dian)泳分離(li)樣品(pin)，然(ran)後將(jiang)分離(li)的(de)蛋白質轉(zhuan)移到(dao)膜(mo)上(shang)。這些膜(mo)與(yu)特(te)定於目標(biao)蛋(dan)白質的(de)抗體壹(yi)起孵(fu)育，該(gai)抗體與(yu)固(gu)定在(zai)膜(mo)上(shang)的(de)蛋白質條(tiao)帶結(jie)合。然後(hou)使(shi)用檢(jian)測(ce)系統對抗體進行可(ke)視化，該(gai)系統通常(chang)基(ji)於與(yu) Ig 鏈(lian)結(jie)合的(de)二(er)級蛋白質，該(gai)蛋(dan)白(bai)質與(yu)顯(xian)色(se)反(fan)應相(xiang)關。
與(yu)理論(lun)預(yu)測(ce)相(xiang)反(fan)，檢測(ce)到幾個波(bo)段(duan)的(de)情(qing)況(kuang)並(bing)不(bu)少見(jian)。雖然抗體可能(neng)並(bing)不(bu)*針對蛋(dan)白(bai)質，但(dan)其他因素(su)可(ke)能(neng)是(shi)原(yuan)因：

1. 抗原的(de)蛋白水解(jie)分解(jie)。
這種情(qing)況(kuang)並(bing)不(bu)少見(jian)，特(te)別(bie)是(shi)如(ru)果(guo)樣品(pin)儲(chu)存時(shi)間過長(chang)，或者在起始組織均(jun)質(zhi)化後(hou)分離(li)蛋白(bai)質或(huo)膜(mo)。所(suo)有附加(jia)條(tiao)帶的(de)表觀分子(zi)量(liang)均(jun)低(di)於全長(chang)蛋白(bai)質(zhi)。特(te)別(bie)易(yi)感的(de)是(shi)突(tu)觸蛋(dan)白(bai)和突(tu)觸結(jie)合蛋白(bai)。應考慮(lv)添加蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑，如(ru) PMSF、胃蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑或(huo)亮(liang)抑(yi)酶(mei)肽。 
2. 每(mei)條(tiao)泳道(dao)蛋(dan)白(bai)質(zhi)過(guo)多或檢測(ce)系統過於敏(min)感。
蛋(dan)白質免(mian)疫印(yin)跡(ji)法中，凝膠(jiao)過(guo)載(zai)是(shi)“鬼(gui)帶"的(de)常(chang)見(jian)原(yuan)因之壹(yi)。固定的(de)蛋白質可以(yi)提(ti)供(gong)壹(yi)個集中的(de)吸(xi)附(fu)表(biao)面，某(mou)些(xie) IgG 可以(yi)非特(te)異性地(di)結(jie)合到該(gai)表(biao)面。類(lei)似地(di)，當(dang)使用(yong)高(gao)度靈(ling)敏(min)的(de)檢測(ce)系統（例(li)如(ru)增(zeng)強(qiang)的(de)化學發(fa)光(guang)）時(shi)，可(ke)能(neng)會(hui)發(fa)現這種非特(te)異性結(jie)合。起始材料的(de)壹(yi)系列稀釋(shi)通(tong)常(chang)會澄(cheng)清(qing)哪些信(xin)號是(shi)人(ren)為的(de)。
3.低效阻塞(sai)。
實驗中會應用到(dao)多種不(bu)同的(de)封閉(bi)劑，某(mou)些(xie)非離(li)子(zi)去(qu)汙(wu)劑或(huo)蛋(dan)白質(zhi)等封閉(bi)劑容(rong)易(yi)產生(sheng)低(di)效(xiao)阻(zu)塞(sai)的(de)影響(xiang)。如果(guo)改變(bian)阻塞(sai)條(tiao)件就(jiu)可(ke)以(yi)解(jie)決(jue)此(ci)問(wen)題(ti)。
4. 抗原濃(nong)度過低(di)。
SDS-PAGE 的(de)分辨率(lv)壹(yi)般(ban)限制(zhi)在 50-100 個波(bo)段(duan)。如(ru)果(guo)抗原的(de)相(xiang)對濃(nong)度過低(di)（小(xiao)於總(zong)蛋白(bai)的(de) 0.2%），則(ze)可(ke)能(neng)難(nan)以(yi)檢測(ce)（例(li)如(ru)，突(tu)觸釋(shi)放蛋白(bai)/VAMP 與(yu)細胞勻(yun)漿(jiang)中的(de)組蛋白共(gong)遷(qian)移，幹擾其檢(jian)測(ce)）。信號增(zeng)強(qiang)可能(neng)會(hui)導(dao)致(zhi)人工(gong)帶的(de)出(chu)現。因此(ci)可以(yi)適(shi)當(dang)考慮(lv)通(tong)過分級分離(li)或免(mian)疫沈(chen)澱(dian)富集抗原。
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