Southern Blot原(yuan)理(li)和實(shi)驗(yan)步驟

Southern Blot印跡定義(yi)：涉(she)及將凝膠上(shang)分離(li)的(de)特定 DNA、RNA 或(huo)蛋白質(zhi)轉(zhuan)移到(dao)載(zai)體(ti)膜上(shang)以進(jin)行(xing)檢(jian)測或(huo)鑒定(ding)的分析技(ji)術稱為(wei)印(yin)跡。

變(bian)性片段從凝(ning)膠(jiao)中(zhong)轉(zhuan)移到(dao)載(zai)體(ti)膜上(shang)的(de)過(guo)程使(shi)其(qi)易(yi)於使(shi)用(yong)探(tan)針(zhen)或(huo)抗體(ti)進(jin)行(xing)分析。

根據要(yao)分離(li)的(de)物質(zhi)，印(yin)跡技術可能(neng)是——Southern印跡、Northern印跡或(huo)Western印跡，它們分別(bie)分離(li)DNA、RNA和(he)蛋白質(zhi)。

Southern Blot是(shi)壹種(zhong)用(yong)於分子生(sheng)物學、免疫(yi)遺(yi)傳(chuan)學和其(qi)他(ta)分子方(fang)法(fa)的分析技(ji)術，用於從 DNA 樣(yang)品(pin)的(de)混合物或(huo) DNA 鏈(lian)中(zhong)的特定堿(jian)基序列中(zhong)檢測或(huo)鑒定(ding)感興(xing)趣(qu)的(de) DNA。

該(gai)技術由分子生(sheng)物學家 EM Southern 於 1975 年(nian)開(kai)發，用(yong)於分析 DNA 限(xian)制性片段中(zhong)的相(xiang)關(guan)基因，因此以他(ta)的名字命(ming)名為 Southern  Blot 印(yin)跡。

Southern Blot 原(yuan)理(li) 

該(gai)過程(cheng)包括(kuo)將電泳(yong)分離(li)的(de) DNA 片段轉(zhuan)移到(dao)通(tong)常(chang)是(shi)NC的(de)載(zai)體(ti)膜上(shang)，然(ran)後(hou)通過(guo)探針(zhen)雜合(he)檢(jian)測目標 DNA 片段。雜合(he)是(shi)指(zhi)在單(dan)鏈(lian)DNA探針(zhen)和單(dan)鏈(lian)靶(ba)DNA之(zhi)間形(xing)成雙鏈(lian)DNA分子的過(guo)程。由(you)於探(tan)針(zhen)和目標 DNA 是(shi)互(hu)補的，因(yin)此(ci)反應是特異性的，有助於檢(jian)測特定的(de) DNA 片段。

Southern Blotting 的基本步驟

從細(xi)胞中(zhong)提(ti)取(qu)和純化 DNA

1.按照(zhao)基因組 DNA 提(ti)取(qu)的標準方(fang)法(fa)從靶(ba)細(xi)胞中(zhong)分離(li) DNA，然(ran)後(hou)進(jin)行(xing)純化。

2.限制(zhi)性消(xiao)化或(huo) DNA 片段化

3.限制(zhi)性內(nei)切酶(mei)用於將(jiang)高(gao)分子量 DNA 鏈(lian)切割(ge)成(cheng)更(geng)小(xiao)的片段。可以使(shi)用(yong)壹種(zhong)或(huo)多種(zhong)限(xian)制(zhi)酶(mei)來獲(huo)得(de)這(zhe)樣的(de)片段。

4.電泳(yong)分離(li)

可(ke)以通過(guo)瓊(qiong)脂(zhi)糖凝(ning)膠(jiao)電泳(yong)進(jin)行(xing)分離(li)，其(qi)中(zhong)帶負電的(de) DNA 片段向帶正電的(de)陽極移動，移動(dong)的(de)距離(li)取(qu)決於其(qi)大(da)小(xiao)。

5.脫(tuo)嘌(piao)呤(ling)

部分脫(tuo)嘌(piao)呤(ling)是(shi)通(tong)過(guo)使(shi)用(yong)稀(xi)釋的 HCl 完成的(de)，它通過(guo)將 DNA 片段分解(jie)成(cheng)更小(xiao)的片段來促(cu)進(jin)更(geng)高(gao)效(xiao)率(lv)的轉(zhuan)移。

6.變(bian)性

然後(hou)用弱堿（例(li)如(ru) NaOH 的(de)堿(jian)性溶液(ye)）使(shi) DNA 變(bian)性。這(zhe)導致雙鏈(lian) DNA 變(bian)成(cheng)單(dan)鏈(lian)，使(shi)其(qi)適(shi)合(he)雜合(he)。然(ran)後(hou)用 NaCl 中(zhong)和 DNA，以防(fang)止在(zai)添(tian)加(jia)探(tan)針之(zhi)前再(zai)次(ci)雜合(he)。

7.印(yin)跡

然後(hou)將變(bian)性片段轉(zhuan)移到(dao)pvdf或(huo)NC膜上(shang)，這(zhe)是通(tong)過將(jiang)凝(ning)膠放在(zai)緩(huan)沖(chong)液(ye)飽和濾(lv)紙(zhi)頂(ding)部，然後(hou)將NC濾(lv)膜放在(zai)凝膠(jiao)頂(ding)部來完成的(de)。最後(hou)將壹些(xie)幹(gan)燥(zao)的濾(lv)紙(zhi)放(fang)在膜的頂(ding)部。碎(sui)片通(tong)過(guo)毛(mao)細作(zuo)用被拉向(xiang)NC膜並導致凝膠的(de)接觸(chu)印(yin)跡。

8.烘(hong)烤(kao)

將(jiang)NC膜從印(yin)跡疊(die)層(ceng)中(zhong)取(qu)出，將附(fu)著(zhe)有單(dan)鏈(lian) DNA 條帶的膜在真(zhen)空中(zhong)或(huo)在 80°C 的(de)常(chang)規烘(hong)箱(xiang)中(zhong)烘(hong)烤(kao) 2-3 小(xiao)時或(huo)暴露(lu)在紫(zi)外線(xian)輻射下(xia)以固(gu)定(ding)狀態附(fu)著(zhe)轉(zhuan)移的(de) DNA到(dao)膜上(shang)。

9.雜合(he)

然(ran)後(hou)將膜暴露(lu)於雜合(he)探(tan)針(zhen)，該(gai)探針(zhen)是具有特定序列的(de)單(dan)個 DNA 片段，其(qi)在(zai)目(mu)標 DNA 中(zhong)的存(cun)在(zai)將被確(que)定。探(tan)針 DNA 被標記(ji)以便可(ke)以被檢(jian)測到(dao)，通(tong)常(chang)通(tong)過(guo)結(jie)合放射(she)性或(huo)用熒(ying)光或(huo)顯色(se)染料(liao)標記(ji)分子。

10.洗滌(di)未(wei)結(jie)合(he)的探針

雜合(he)後(hou)，用緩(huan)沖液(ye)*清(qing)洗膜以去除非特異性結合(he)的探(tan)針(zhen)或(huo)存(cun)在(zai)的任何(he)未結(jie)合的(de)探(tan)針。

11.放射自顯影

通過(guo)將NC膜與顯(xian)示(shi)雜合(he)DNA分子的照(zhao)相膠(jiao)片接觸(chu)，通(tong)過放射自(zi)顯(xian)影檢測雜合(he)區域(yu)。在(zai)使(shi)用(yong)放(fang)射(she)性或(huo)熒光探(tan)針(zhen)的情況(kuang)下(xia)，通(tong)過(guo)放(fang)射(she)自顯影在 X 射(she)線(xian)膠(jiao)片上(shang)顯(xian)示(shi)雜合(he)模(mo)式，如(ru)果(guo)使(shi)用(yong)顯(xian)色(se)檢測方(fang)法(fa)，則(ze)通(tong)過在膜上(shang)顯(xian)色(se)來觀察(cha)雜合(he)模(mo)式。

Southern 應用

l 識別(bie) DNA 樣(yang)本中(zhong)的特定 DNA。

l RFLP（限(xian)制(zhi)性片段長度多態性）圖的(de)制(zhi)備(bei)

l 檢(jian)測 DNA 中(zhong)的突變(bian)、缺(que)失或(huo)基因重排

l 用(yong)於識別(bie) DNA 指(zhi)紋(wen)識別(bie) (VNTR)

l 轉(zhuan)基因個體(ti)中(zhong)轉(zhuan)基因的檢測與鑒(jian)定(ding)

l 限制位(wei)點的(de)映射

l 用(yong)於傳(chuan)染病(bing)診(zhen)斷

l 癌癥的預(yu)後(hou)和遺(yi)傳(chuan)病(bing)的產前診(zhen)斷

l 測定限制性片段的分子量並測量不同(tong)樣(yang)品(pin)中(zhong)的相(xiang)對(dui)量。

     蘇(su)州阿(e)爾法(fa)生(sheng)物13年(nian)專註於生(sheng)命(ming)科學行業，所(suo)供(gong)應的振(zhen)蕩(dang)培養(yang)箱(xiang)、移液(ye)器(qi)、離(li)心(xin)機、離(li)心(xin)濃(nong)縮(suo)儀、均質(zhi)機(ji)、PCR儀、熒光定(ding)量PCR儀、電泳(yong)槽、電泳(yong)儀、電泳(yong)儀電源、凝膠成(cheng)像(xiang)儀、離(li)心(xin)管、吸頭、培養(yang)瓶、滾(gun)瓶等(deng)實(shi)驗(yan)室(shi)儀器和(he)實(shi)驗(yan)室(shi)試劑(ji)耗(hao)材廣泛應用於分子生(sheng)物學、細胞生(sheng)物學、蛋白質(zhi)組(zu)學等領域(yu)。