如(ru)何(he)選(xuan)擇基(ji)因(yin)測序方法(fa)

當(dang)今的主(zhu)要技(ji)術基(ji)因(yin)測序技(ji)術相對(dui)成(cheng)熟(shu)，DNA測序的主(zhu)要方(fang)法(fa)有(you)Sanger 測序、下(xia)壹(yi)代測序 (NGS) 和長讀長測(ce)序。如何(he)選(xuan)擇基(ji)因(yin)測序方法(fa)。以下(xia)是對(dui)這(zhe)些方法(fa)、優(you)缺點和重(zhong)要標(biao)準的簡要回顧(gu)，可(ke)幫(bang)助您(nin)權衡(heng)下(xia)壹(yi)個測序選擇。

選擇測序方法(fa)的標準

選擇測序方法(fa)的標準很多，取(qu)決於(yu)研究人員及(ji)其(qi)項目(mu)的性質。正在(zai)研究的生(sheng)物學問(wen)題(ti)是關(guan)鍵(jian)。Pacific Biosciences 副總裁 Jonas Korlach 說：“研究的背(bei)景(jing)決定(ding)了使用哪種類型(xing)的測序，因為不(bu)同的測序方法(fa)具有不(bu)同的特征(zheng)來推動選(xuan)擇。"

常見的標準包括測序時間、通量、成本(ben)和準確(que)度(du)——所(suo)有這(zhe)些往往會(hui)相(xiang)互(hu)影響(xiang)。“準確(que)性、成本(ben)和數(shu)據(ju)吞吐量之間(jian)的動態(tai)壹(yi)直是測序技(ji)術選擇的驅動因(yin)素(su)，在(zai)不犧牲(sheng)準確(que)度(du)的情況(kuang)下(xia)，成(cheng)本(ben)和(he)通量的提高推動了 DNA 測序對(dui)廣(guang)泛的應(ying)用。"

測序實驗室成(cheng)本主(zhu)要包括購買儀(yi)器費(fei)用、實驗室試劑(ji)耗材(cai)費(fei)用、樣本數量、計(ji)劃(hua)外包測序及(ji)測(ce)序前(qian)的準備步(bu)驟。還(hai)有另壹(yi)個值得考慮(lv)的因素是要測(ce)序的目(mu)標的大(da)小(xiao)，這會(hui)也(ye)影響(xiang)測(ce)序時間和(he)成(cheng)本(ben)。

測(ce)序過程(cheng)中(zhong)產(chan)生(sheng)的讀取(qu)長度(du)也可(ke)能會影響(xiang)決(jue)策，因為其(qi)中(zhong)壹(yi)些些(xie)應(ying)用需(xu)要較(jiao)長的讀取(qu)長度(du)。比(bi)如(ru)：NGS 產(chan)生(sheng)MIN讀長（約 50-500 bp），其次是 Sanger 測序（約 500-1000 bp），然(ran)後(hou)是長讀長測(ce)序（約 5-30 kb）。

桑(sang)格測(ce)序

Sanger 測序是壹(yi)項久(jiu)經考(kao)驗的技(ji)術，對(dui)於(yu)少量樣本(ben)來說簡(jian)單快速(su)，能夠解析(xi)單個堿(jian)基(ji)對(dui)。它(ta)在(zai)摻入放(fang)射(she)性標記(ji)的核苷(gan)酸(suan)類似(si)物後(hou)通過(guo)鏈(lian)終止(zhi)起(qi)作用。然(ran)後(hou)通過(guo)瓊脂(zhi)糖凝(ning)膠(jiao)電泳分(fen)離(li)得到的 基(ji)因(yin)片段以進行(xing)鑒(jian)定。Sanger 方(fang)法(fa)對(dui)包含重復(fu)和二(er)級結(jie)構(gou)的復(fu)雜(za) DNA 區(qu)域(yu)很(hen)有(you)幫(bang)助，並(bing)且(qie)通常(chang)被(bei)用作驗證 NGS 檢測(ce)到的遺傳(chuan)變(bian)異的正交方法(fa)。

但(dan)是，與 NGS 相(xiang)比(bi)，Sanger 測(ce)序的通量較(jiao)低，因(yin)此可(ke)能不適合大(da)型(xing)項目(mu)。Sanger 測序可(ke)以對(dui)較(jiao)小(xiao)的 DNA 區(qu)域(yu)、壹(yi)小(xiao)組基(ji)因(yin)以及(ji)通常(chang)少(shao)於 1000 個樣本(ben)進行(xing)高準確(que)的測序。

事實上，對(dui)於(yu)較(jiao)小(xiao)範圍的項目(mu)，使用 Sanger 基(ji)因(yin) 測序方法(fa)進行(xing)靶向(xiang)或(huo)聚焦(jiao)測(ce)序的項目(mu)時間、成(cheng)本(ben)和(he)復(fu)雜(za)性要低(di)得多，通常(chang)使(shi)用的是細管電泳法(fa)，即(ji)：在(zai)毛細管電泳儀(yi)器上的毛細管內使用 Sanger 測序化學，有助於(yu)查(zha)明(ming)基(ji)因(yin)片段中(zhong)的單個堿(jian)基(ji)。

新(xin)壹(yi)代測序

測序目(mu)標的會嚴(yan)重影響(xiang)到測(ce)序方法(fa)的選擇。Sanger 測序適合(he)少(shao)量基(ji)因(yin)或(huo)短基(ji)因(yin)組片段。NGS 測(ce)序發(fa)則(ze)適(shi)合(he)用於 大(da)面(mian)積(ji)的基(ji)因(yin)組或(huo)全基(ji)因(yin)組測序。 與使(shi)用 Sanger 測序相比(bi)，NGS 測(ce)序法(fa)具有高通量的特點可(ke)以使大(da)型(xing)項目(mu)快速(su)、容易、低成(cheng)本(ben)地進行(xing)完成(cheng)測(ce)序。所(suo)以NGS 是全基(ji)因(yin)組測序、全外(wai)顯(xian)子(zi)組測(ce)序、分析(xi)大(da)型(xing)基(ji)因(yin)組、檢測稀有(you)變(bian)異以及(ji)發(fa)現(xian)和(he)診(zhen)斷(duan)的較(jiao)為理想的選擇。然(ran)而(er)，對(dui)於(yu)靶向測(ce)序，NGS 可(ke)能比(bi) Sanger 貴。同時，NGS 所(suo)使用的 NGS 測序儀，儀(yi)器(qi)成本較(jiao)高，而且(qie)NGS 工作(zuo)流(liu)程(cheng)比(bi) Sanger 測(ce)序更復(fu)雜(za)，

長讀長測(ce)序

   在(zai)長讀長測(ce)序中(zhong)，基(ji)因(yin)片段在(zai)穿過納米(mi)孔時單獨(du)測(ce)序（Oxford Nanopore Technologies），或(huo)者(zhe)在(zai)單個小(xiao)孔中(zhong)復(fu)制。較(jiao)長的重疊(die)序列使(shi)組(zu)裝更(geng)容易，就像用更少的大(da)塊(kuai)拼圖拼(pin)圖，而(er)不(bu)是 NGS 中(zhong)更(geng)多的小(xiao)塊。其(qi)他(ta)優(you)點(dian)包括消除了擴增偏差(cha)，並(bing)且(qie)可(ke)以更容易地檢(jian)測(ce)到大(da)插入/缺失(shi)、重復(fu)區(qu)域(yu)等特征(zheng)。長讀長測(ce)序的錯(cuo)誤率(lv)可(ke)能高於 NGS，但持續(xu)的技(ji)術改進正在(zai)縮小(xiao)準確(que)度(du)的差(cha)距。