GFP抗(kang)體在蛋白質(zhi)標(biao)記(ji)應用中的常見問(wen)題(ti)

GFP抗(kang)體在蛋白質(zhi)標(biao)記(ji)應用中的常見問(wen)題(ti)

標(biao)簽(qian)：抗(kang)體  蛋白質(zhi)結(jie)構 科(ke)學  科普(pu) GFP抗(kang)體

GFP適合(he)於(yu)蛋(dan)白質(zhi)標(biao)記(ji)，這(zhe)是(shi)該抗體(ti)的天然(ran)優勢。雖(sui)然它非常適合(he)實(shi)時成像，例(li)如，作為 TP53 MITE-seq 屏幕的報告器，其(qi)他(ta)應用導(dao)致(zhi) GFP 熒光(guang)猝(cu)滅(mie)，這(zhe)使(shi)得有(you)必要使(shi)用抗 GFP 抗體(ti)。組織(zhi)樣本(ben)的冷凍(dong)保(bao)存(cun)、組織(zhi)學制(zhi)備(bei)和固定(ding)劑的使(shi)用通(tong)常會(hui)導(dao)致(zhi) GFP 熒光(guang)*或(huo)部分(fen)喪失(shi)，因(yin)此(ci)需(xu)要使(shi)用抗 GFP 抗體(ti)來(lai)獲(huo)得可(ke)靠的結果(guo)。

通(tong)過蛋白質(zhi)印(yin)跡(ji)檢(jian)測(ce) GFP 標(biao)記(ji)的蛋白質(zhi)和通(tong)過免疫(yi)沈(chen)澱(dian)研究蛋白質(zhi) -蛋(dan)白質(zhi)相(xiang)互作用也需(xu)要使(shi)用 GFP 抗體。抗(kang)GFP抗(kang)體(ti)可(ke)用作多(duo)克(ke)隆或(huo)單克(ke)隆抗(kang)體，適用於(yu)在蛋白質(zhi)印(yin)跡(ji)、免(mian)疫(yi)沈(chen)澱(dian)、免疫(yi)組織(zhi)化(hua)學、免疫(yi)細胞(bao)化(hua)學定(ding)位和免疫(yi)吸(xi)附測(ce)定(ding) (ELISA) 上(shang)檢(jian)測(ce) GFP、GFP 變(bian)體和 GFP 融(rong)合(he)蛋白。

GFP的分(fen)子(zi)結(jie)構與特征(zheng)
GFP 形成壹(yi)個比(bi)較(jiao)穩定(ding)的桶形結(jie)構，由(you)圍(wei)繞中(zhong)央 α 螺(luo)旋(xuan)的 11 個 β折疊組成。β 表通(tong)過富(fu)含脯氨(an)酸(suan)的環連(lian)接。每個片層中的氨基(ji)酸側(ce)鏈(lian)交替突出到蛋(dan)白質(zhi)內(nei)部或(huo)從表(biao)面向(xiang)外突出。GFP 發色(se)團(tuan)由(you) Ser65、Tyr66 和 Gly67 的分(fen)子(zi)內(nei)環化(hua)形成，它幾乎位於(yu)環(huan) 的中心(xin)。盡管這(zhe)三個(ge)氨基酸(suan)基(ji)序在自然(ran)界(jie)中很(hen)常見，但(dan)它不(bu)會(hui)產(chan)生(sheng)熒光(guang)。

正是(shi) GFP β-*的內(nei)部環(huan)境產(chan)生(sheng)了發(fa)色(se)團(tuan)並(bing)保(bao)護它免於(yu)猝(cu)滅(mie)。發(fa)色(se)團(tuan)的形成是(shi)自催化(hua)的。GFP 以 Max激發(fa)波(bo)長(chang)為(wei) 395 nm 的主要質(zhi)子(zi)化(hua)狀態(tai)和具有(you) 475 nm 激發(fa)峰的不(bu)那麽普遍的非質(zhi)子(zi)化(hua)狀態(tai)存在。兩種形式(shi)的熒光(guang)發(fa)射均在 510 nm 處(chu)達到峰(feng)值(zhi)。

抗 GFP 抗(kang)體是(shi)否(fou)也識別 GFP 的變(bian)體？
抗(kang) GFP 抗(kang)體可(ke)識別 Aequorea victoria GFP 的其(qi)他(ta)變(bian)體。
為(wei)什麽(me)在蛋白質(zhi)印(yin)跡(ji)上(shang)沒(mei)有抗(kang) GFP 抗(kang)體(ti)的信號(hao)？

蛋白質(zhi)印(yin)跡(ji)後缺乏(fa)信號(hao)可(ke)能表(biao)明(ming)存在壹(yi)些(xie)不(bu)同(tong)的問題(ti)。沒(mei)有或(huo)非(fei)常差的傳輸(shu)意味著沒(mei)有信(xin)號(hao)。可(ke)以通(tong)過 Ponceau-S 染色(se)檢(jian)查缺乏(fa)良好的膜轉(zhuan)移。氣泡的存在也會(hui)導(dao)致(zhi)轉(zhuan)印不(bu)良。GFP 標(biao)記(ji)蛋(dan)白的表達(da)水(shui)平(ping)可(ke)能太(tai)低(di)。加(jia)載(zai)更(geng)大體積的樣品(pin)並(bing)包(bao)括陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)。非(fei)常稀釋(shi)的抗體(ti)可(ke)能是(shi)問(wen)題所在，嘗(chang)試使(shi)用幾種不(bu)同(tong)濃度(du)的抗體(ti)來探測(ce)蛋白質(zhi)印(yin)跡(ji)。此(ci)外，壹(yi)種遙(yao)遠(yuan)的可(ke)能性(xing)是(shi) GFP 標(biao)簽(qian)超(chao)出幀(zhen)並(bing)且(qie)未(wei)表達(da)，導(dao)致(zhi)缺少(shao)任(ren)何(he)信號(hao)。

GFP信號(hao)太弱(ruo)無(wu)法成像，可(ke)以增強信號(hao)嗎(ma)？
在某些(xie)實(shi)驗條件下，GFP 熒光(guang)會(hui)部(bu)分(fen)或*丟失(shi)。因(yin)此(ci)，壹(yi)些(xie)表達(da) GFP 標(biao)記(ji)蛋(dan)白的細胞(bao)結構可(ke)能難(nan)以可(ke)視化(hua)或成像。 GFP-Booster 是(shi)壹(yi)種源自駱(luo)駝(tuo)科(ke)動物(wu)的 VHH 結構域(yu)結合(he)蛋白，與強熒光(guang)染(ran)料(liao)偶(ou)聯。這(zhe)穩(wen)定(ding)並(bing)增(zeng)強了熒光(guang)信(xin)號(hao)。

為什麽(me)用抗 GFP抗體(ti)進(jin)行(xing)免(mian)疫(yi)沈(chen)澱(dian)後會(hui)觀(guan)察(cha)到(dao)多(duo)個(ge)條帶(dai)？
抗(kang)體(ti)交(jiao)叉反應是(shi)壹(yi)個常見問(wen)題(ti)，通(tong)常會(hui)導(dao)致(zhi)比(bi)預(yu)期更多(duo)的條帶(dai)。更(geng)嚴格(ge)的實(shi)驗條件可(ke)能會(hui)解(jie)決(jue)這(zhe)個(ge)問(wen)題(ti)。GFP-Trap 可(ke)用於(yu)免(mian)疫(yi)沈(chen)澱(dian)實(shi)驗。GFP-Trap 是(shi)壹(yi)種單域(yu)抗體(ti)（源自駱(luo)駝(tuo)科(ke)動物(wu)），具有(you)更高的特異性(xing)、穩定(ding)性(xing)和親和力(li)。然而(er)，必(bi)須(xu)考慮到(dao)，如果(guo)產(chan)生(sheng)了截短(duan)的融(rong)合(he)蛋白，如(ru)果(guo)存在標(biao)簽(qian)，這(zhe)些(xie)也將(jiang)被抗(kang)體(ti)檢測(ce)到，並(bing)導(dao)致(zhi)多(duo)個(ge)條帶(dai)。