染色質免疫(yi)共(gong)沈澱(dian)（ChIP）技術(shu)介(jie)紹

染色質免疫(yi)共(gong)沈澱(dian)可以(yi)：（1）組蛋白修(xiu)飾(shi)酶(mei)的抗體(ti)作為(wei)“生(sheng)物標(biao)記(ji)"；（2）轉(zhuan)錄調控(kong)分析；（3）藥(yao)物(wu)開發研(yan)究(jiu)；（4）DNA損(sun)失(shi)與(yu)雕(diao)亡(wang)分析。

1實驗(yan)方(fang)法原(yuan)理(li)：

在保(bao)持組(zu)蛋白和DNA聯(lian)合(he)的同(tong)時，通(tong)過(guo)運(yun)用(yong)對應於壹個(ge)特定組蛋白標記(ji)的生(sheng)物抗體(ti)，染(ran)色質被切成很小(xiao)的片斷(duan)，並沈澱(dian)下(xia)來(lai)。

IP是(shi)利用(yong)抗原(yuan)蛋白質和抗體(ti)的特異(yi)性結(jie)合(he)以及(ji)細菌(jun)蛋白質的“prorein A"特異(yi)性地結合(he)到(dao)免疫(yi)球(qiu)蛋白的FC片段的現象活用(yong)開發(fa)出來(lai)的方(fang)法。

目前多用(yong)精制的prorein A預先結(jie)合(he)固化(hua)在(zai)argarose的beads上，使(shi)之(zhi)與(yu)含有抗原(yuan)的溶液及(ji)抗體(ti)反(fan)應後(hou)，beads上的prorein A就能(neng)吸附抗原(yuan)達(da)到(dao)精制的目的。

2實驗(yan)材(cai)料(liao)、試(shi)劑(ji)、儀器(qi)耗(hao)材(cai)：

細胞(bao)樣品

甲(jia)醛(quan)、甘(gan)氨酸、PBS、SDS、 Lysis Buffer、洗脫(tuo)液、RNaseA、蛋白酶(mei)K、omega膠回(hui)收(shou)試(shi)劑(ji)盒等

離心(xin)管(guan)、超聲儀(yi)、電(dian)泳儀(yi)、離心(xin)機(ji)等

3實驗(yan)步(bu)驟(zhou)：

壹、細(xi)胞的甲(jia)醛(quan)交(jiao)聯(lian)與(yu)超聲破(po)碎

1. 取(qu)出1平皿細胞（10 cm平皿），加(jia)入(ru)243 ul 37%甲(jia)醛(quan)，使(shi)得甲(jia)醛(quan)的終(zhong)濃度為(wei)1%（培(pei)養(yang)基共(gong)有9 ml）。

2. 37℃孵(fu)育10 min。

3. 終(zhong)止交(jiao)聯(lian)：加(jia)甘(gan)氨(an)酸至(zhi)終(zhong)濃度為(wei)0.125 M。450 ul 2.5 M甘(gan)氨(an)酸於平皿中(zhong)。混勻(yun)後(hou)，在室溫(wen)下(xia)放(fang)置5 min即可。

4. 吸盡(jin)培養(yang)基，用(yong)冰(bing)冷(leng)的PBS清洗細胞(bao)2次(ci)。

5. 細胞(bao)刮(gua)刀(dao)收(shou)集(ji)細胞(bao)於15 ml離心(xin)管(guan)中(zhong)（PBS依次(ci)為(wei)5 ml，3 ml和3 ml）。預冷(leng)後(hou)2 000 rpm 5 min收(shou)集(ji)細胞(bao)。

6. 倒(dao)去上(shang)清(qing)。按(an)照(zhao)細胞(bao)量(liang)，加(jia)入(ru)SDS Lysis Buffer。使得(de)細胞終(zhong)濃度為(wei)每(mei)200ul含2×106個(ge)細(xi)胞(bao)。這樣每(mei)100 ul溶液含1×106個細(xi)胞(bao)。再加(jia)入(ru)蛋白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)復合(he)物。假(jia)設(she)MCF7長(chang)滿板為(wei)5×106個(ge)細(xi)胞(bao)。本(ben)次(ci)細(xi)胞(bao)長(chang)得約為(wei)80%。即(ji)為(wei)4×106個(ge)細(xi)胞(bao)。因(yin)此每(mei)管(guan)加(jia)入(ru)400 ul SDS Lysis Buffer。將2管(guan)混(hun)在壹(yi)起，共800 ul。

7. 超聲破(po)碎：VCX750，25%功(gong)率(lv)，4.5 s沖(chong)擊(ji)，9 s間(jian)隙。共(gong)14次。

二、除雜(za)及(ji)抗體(ti)哺育 

1. 超聲破(po)碎結束後(hou)，10 000 g 4℃離心(xin)10 min。去(qu)除(chu)不(bu)溶(rong)物(wu)質。

2. 留(liu)取(qu)300ul做實驗(yan)，其(qi)余(yu)保(bao)存於-80℃。

3. 300 ul中(zhong)，100 ul加(jia)抗體(ti)做為(wei)實驗(yan)組(zu)；100 ul不(bu)加(jia)抗體(ti)做為(wei)對(dui)照(zhao)組；100 ul加(jia)入(ru)4 ul 5 M NaCl（NaCl終(zhong)濃度為(wei)0.2 M），65℃處理(li)3 h解(jie)交(jiao)聯(lian)，跑(pao)電(dian)泳，檢(jian)測超聲破(po)碎的效果(guo)。

4. 在100 ul的超聲破(po)碎產物中(zhong)，加(jia)入(ru)900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。

再各(ge)加(jia)入(ru)60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉混(hun)勻(yun)1 h。

5. 1 h後(hou)，在4℃靜置10 min沈澱(dian)，700 rpm離心(xin)1 min。

6. 取(qu)上(shang)清(qing)。各(ge)留(liu)取(qu)20 ul做為(wei)input。壹(yi)管(guan)中(zhong)加(jia)入(ru)1 ul抗體(ti)，另(ling)壹(yi)管(guan)中(zhong)則不(bu)加(jia)抗體(ti)。4℃顛轉過(guo)夜(ye)。

三(san)、檢(jian)驗超聲破(po)碎的效果(guo) 

1. 取(qu)100 ul超聲破(po)碎後(hou)產物，加(jia)入(ru)4 ul 5M NaCl，65℃處理(li)2 h解(jie)交(jiao)聯(lian)。

2. 分出壹半(ban)用(yong)酚/氯(lv)仿抽提。電(dian)泳檢(jian)測超聲效果(guo)。

四、免疫(yi)復(fu)合(he)物的沈澱(dian)及(ji)清洗（ 第二天）

1. 孵(fu)育過(guo)夜(ye)後(hou)，每(mei)管(guan)中(zhong)加(jia)入(ru)60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃顛轉2 h。

2. 4℃靜置10 min後(hou)，700 rpm離心(xin)1 min。除(chu)去(qu)上(shang)清(qing)。

3. 依次(ci)用(yong)下(xia)列溶液清洗沈澱(dian)復合(he)物。清(qing)洗的步(bu)驟(zhou)：加(jia)入(ru)溶液，在4℃顛轉10 min，4℃靜置10 min沈澱(dian)，700 rpm離心(xin)1 min，除(chu)去(qu)上(shang)清(qing)。

洗滌溶(rong)液：

（1）low salt wash buffer-one wash

（2）highsalt wash buffer-one wash

（3）LiCl wash buffer-one wash

（4）TE buffer-two wash

4. 清洗完(wan)畢後(hou)，開始洗脫(tuo)。

洗脫(tuo)液的配(pei)方(fang)：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO3，800 ul ddH2O，共1 ml。

每(mei)管(guan)加(jia)入(ru)250 ul洗脫(tuo)buffer，室溫(wen)下(xia)顛轉15 min，靜(jing)置離心(xin)後(hou)，收(shou)集(ji)上清(qing)。重復(fu)洗滌壹(yi)次(ci)。最終(zhong)的洗脫(tuo)液為(wei)每(mei)管(guan)500 ul。

5. 解交(jiao)聯(lian)：每(mei)管(guan)中(zhong)加(jia)入(ru)20 ul 5M NaCl（NaCl終(zhong)濃度為(wei)0.2 M）。

6. 混勻(yun)，65℃解交(jiao)聯(lian)過(guo)夜(ye)。

五(wu)、DNA樣品的回收(shou)（第三(san)天）

1. 解交(jiao)聯(lian)結(jie)束後(hou)，每(mei)管(guan)加(jia)入(ru)1 ul RNaseA（MBI），37℃孵(fu)育1 h。

2. 每(mei)管(guan)加(jia)入(ru)10 ul 0.5 M EDTA，20 ul1M Tris.HCl（PH6.5），2 ul 10 mg/ml蛋白酶(mei)K。45℃處理(li)2 h。

3. DNA片段的回收(shou)----omega膠回(hui)收(shou)試(shi)劑(ji)盒。最終(zhong)的樣品溶於100 ul ddH2O。

六、PCR分析（第三(san)天）

ChIP-chip技術(shu)對於大規(gui)模挖掘(jue)順式(shi)調控(kong)信(xin)息成(cheng)績(ji)不(bu)錯，同(tong)時它(ta)可(ke)以(yi)用(yong)於胚胎(tai)幹細(xi)胞(bao)和壹(yi)些疾(ji)病如(ru)癌癥(zheng)、心血(xue)管(guan)疾(ji)病和神(shen)經(jing)紊亂的發生(sheng)的機(ji)制。研(yan)究(jiu)人員(yuan)還可以利用(yong)這項(xiang)技術(shu)開發(fa)壹些治(zhi)療(liao)方(fang)法。目前ChIP-chip技術(shu)研(yan)究(jiu)主要(yao)集(ji)中(zhong)於兩個領域：及(ji)轉錄因(yin)子(zi)的結合(he)和條(tiao)件(jian)特(te)異性；組蛋白的修(xiu)飾(shi)，組(zu)蛋白修(xiu)飾(shi)蛋白和染(ran)色體(ti)重建。

ChIP-chip在描(miao)述轉錄結(jie)合(he)因子(zi)動力學中(zhong)的研(yan)究(jiu)、染色體(ti)結(jie)構(gou)組(zu)分的分布、在(zai)組(zu)蛋白的修(xiu)飾(shi)、組(zu)蛋白修(xiu)飾(shi)蛋白和染(ran)色體(ti)重建中(zhong)的應用(yong)也十分廣(guang)泛(fan)。ChIP-chip 技術(shu)的優點是(shi)，可以(yi)在(zai)體(ti)內(nei)進行(xing)反應；在給(gei)定的檢(jian)驗細(xi)胞環境(jing)的模式(shi)下(xia)得(de)到(dao)DNA相互(hu)關(guan)系(xi)的簡單影(ying)像；使用(yong)特異(yi)性修(xiu)正(zheng)抗體(ti)鑒(jian)定與包含有(you)壹(yi)個(ge)特異性(xing)後(hou)轉錄修(xiu)正(zheng)的蛋白質的相關(guan)位(wei)點；直(zhi)接或者間(jian)接(jie)（通(tong)過蛋白質與(yu)蛋白質的相互(hu)作用(yong)）的鑒(jian)別(bie)基(ji)因(yin)組與蛋白質的相關(guan)位(wei)點。缺(que)點是(shi)：需要(yao)壹(yi)個(ge)特異性(xing)蛋白質抗體(ti)，有(you)時(shi)難(nan)於獲得(de)；為(wei)了獲(huo)得(de)高豐(feng)度(du)的結合(he)片段，必(bi)須實驗(yan)演(yan)示(shi)胞(bao)內(nei)條(tiao)件(jian)下(xia)靶(ba)標蛋白質的表達(da)情況(kuang)；調控(kong)蛋白質的基因(yin)的獲取(qu)可(ke)能(neng)需(xu)要限制在(zai)組(zu)織來(lai)源(yuan)中(zhong)。

總(zong)之(zhi)，ChIP-chip 技(ji)術的發展(zhan)為(wei)析(xi)活細胞(bao)或組織中(zhong)DNA與蛋白質的相互(hu)關(guan)系(xi)提(ti)供(gong)了壹(yi)個(ge)極為(wei)有(you)力(li)的工具(ju)。在(zai)未來(lai)的研(yan)究(jiu)中(zhong)，將對(dui)芯片(pian)的構建進行(xing)改進，提(ti)高其(qi)實用(yong)性。使(shi)用(yong)易於獲得(de)抗體(ti)，增加(jia)這(zhe)種(zhong)方(fang)法的可用(yong)性。

在PCR分析這(zhe)壹(yi)塊，比較(jiao)傳(chuan)統(tong)的做法是(shi)半(ban)定量(liang)-PCR。但是(shi)現在(zai)隨(sui)著熒(ying)光(guang)定量(liang)PCR的普及(ji)，大家(jia)也越來(lai)越傾(qing)向於Q-PCR了。此外還有壹些由ChIP衍生(sheng)出來(lai)的方(fang)法。例如RIP（其(qi)實就(jiu)是(shi)用(yong)ChIP的方(fang)法研(yan)究(jiu)細胞(bao)內(nei)蛋白與RNA的相互(hu)結合(he)，具(ju)體(ti)方(fang)法和ChIP差(cha)不多(duo)，只是(shi)實驗(yan)過(guo)程(cheng)中(zhong)要註(zhu)意防止RNase，最後(hou)分析的時候(hou)需要(yao)先(xian)將(jiang)RNA逆轉錄成(cheng)為(wei)cDNA）；還有ChIP-chip（其(qi)實就(jiu)是(shi)ChIP富集(ji)得到(dao)的DNA-片段，拿去做芯片(pian)分析，做法在ChIP的基礎(chu)上有(you)所(suo)改變(bian)，不(bu)同(tong)的公(gong)司(si)有(you)不(bu)同(tong)的做法，要根(gen)據(ju)公(gong)司(si)的要求(qiu)來(lai)準備樣品）。

4註意事項(xiang)：

1. 註意抗體(ti)的性質(zhi)。抗體(ti)不(bu)同(tong)和抗原(yuan)結(jie)合(he)能力(li)也(ye)不(bu)同(tong)，免染(ran)能(neng)結合(he)未必(bi)能(neng)用(yong)在IP反(fan)應。建議仔(zai)細(xi)檢(jian)查(zha)抗體(ti)的說明(ming)書(shu)。特別(bie)是(shi)多抗的特異(yi)性是(shi)問(wen)題(ti)。

2. 註意溶解(jie)抗原(yuan)的緩(huan)沖(chong)液的性質(zhi)。多數(shu)的抗原(yuan)是(shi)細胞(bao)構(gou)成(cheng)的蛋白，特別(bie)是(shi)骨架(jia)蛋白，緩(huan)沖(chong)液必(bi)須要使其(qi)溶(rong)解(jie)。為(wei)此，必(bi)須使用(yong)含有(you)強界面(mian)活性劑(ji)的緩(huan)沖(chong)液，盡(jin)管(guan)它(ta)有可(ke)能影(ying)響壹部分抗原(yuan)抗體(ti)的結合(he)。另壹(yi)面(mian)，如(ru)用(yong)弱界(jie)面活性劑(ji)溶解(jie)細(xi)胞，就(jiu)不能(neng)充分溶解(jie)細(xi)胞蛋白。即便(bian)溶(rong)解(jie)也(ye)產生(sheng)與其(qi)它(ta)的蛋白結合(he)的結果(guo)，抗原(yuan)決(jue)定族被封閉，影(ying)響與抗體(ti)的結合(he)，即使(shi)IP成(cheng)功(gong)，也是(shi)很多(duo)蛋白與抗體(ti)共(gong)沈的悲慘(can)結果(guo)。

3. 為(wei)防止蛋白的分解，修(xiu)飾(shi)，溶(rong)解(jie)抗原(yuan)的緩(huan)沖(chong)液必(bi)須加(jia)蛋白每(mei)抑(yi)制劑(ji)，低溫(wen)下(xia)進行(xing)實驗(yan)。每(mei)次實驗(yan)之(zhi)前，首(shou)先考(kao)慮抗體(ti)/緩(huan)沖(chong)液的比例。抗體(ti)過(guo)少(shao)就(jiu)不能檢(jian)出抗原(yuan)，過(guo)多(duo)則(ze)就(jiu)不能沈降(jiang)在beads上(shang)，殘存在上清。緩(huan)沖(chong)劑(ji)太少則不(bu)能(neng)溶(rong)解(jie)抗原(yuan)，過(guo)多(duo)則(ze)抗原(yuan)被稀(xi)釋。

5其(qi)他(ta)：

壹、染(ran)色質免疫(yi)共(gong)沈澱(dian)簡介(jie)

真核生(sheng)物的基因(yin)組DNA以(yi)染(ran)色質的形(xing)式(shi)存在。因此，研(yan)究(jiu)蛋白質與(yu)DNA在染(ran)色質環(huan)境(jing)下(xia)的相互(hu)作用(yong)是(shi)闡明(ming)真(zhen)核生(sheng)物基(ji)因(yin)表(biao)達機(ji)制的基本(ben)途(tu)徑(jing)。染(ran)色質免疫(yi)沈澱(dian)技術(shu)（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是(shi)目前研(yan)究(jiu)體(ti)內(nei)DNA與(yu)蛋白質相(xiang)互(hu)作用(yong)的方(fang)法。它(ta)的基本(ben)原(yuan)理(li)是(shi)在活細胞(bao)狀(zhuang)態(tai)下(xia)固定蛋白質－DNA復(fu)合(he)物，並將其(qi)隨(sui)機(ji)切斷為(wei)壹(yi)定長(chang)度範(fan)圍(wei)內(nei)的染色質小(xiao)片(pian)段，然後(hou)通過(guo)免疫(yi)學方(fang)法沈澱(dian)此復合(he)體(ti)，特(te)異(yi)性(xing)地富集(ji)目的蛋白結合(he)的DNA片段，通過對目的片斷(duan)的純化(hua)與檢(jian)測，從(cong)而獲(huo)得蛋白質與(yu)DNA相互(hu)作用(yong)的信(xin)息。CHIP不(bu)僅(jin)可(ke)以檢(jian)測體(ti)內(nei)反(fan)式因(yin)子與DNA的動態作用(yong)，還可以用(yong)來(lai)研(yan)究(jiu)組蛋白的各種(zhong)共價(jia)修(xiu)飾(shi)與(yu)基(ji)因表達的關(guan)系(xi)。而且，CHIP與其(qi)他(ta)方(fang)法的結合(he)，擴大(da)了其(qi)應用(yong)範圍(wei)：CHIP與基(ji)因芯片(pian)相(xiang)結(jie)合(he)建立的CHIP-on-chip方(fang)法已(yi)廣(guang)泛(fan)用(yong)於特定反式因子靶(ba)基因(yin)的高通(tong)量(liang)篩選；CHIP與(yu)體(ti)內(nei)足(zu)跡(ji)法(fa)相(xiang)結(jie)合(he)，用(yong)於尋(xun)找反(fan)式因(yin)子的體(ti)內(nei)結(jie)合(he)位(wei)點；RNA-CHIP用(yong)於研(yan)究(jiu)RNA在基(ji)因表達調控(kong)中(zhong)的作用(yong)。由此可見(jian)，隨(sui)著CHIP的進壹(yi)步(bu)完(wan)善(shan)，它必(bi)將(jiang)會(hui)在(zai)基(ji)因(yin)表達調控(kong)研(yan)究(jiu)中(zhong)發揮(hui)越來(lai)越重要(yao)的作用(yong)。

二、ChIP的壹般(ban)流(liu)程(cheng)

甲(jia)醛(quan)處理(li)細(xi)胞(bao)---收(shou)集(ji)細胞(bao)，超聲破(po)碎---加(jia)入(ru)目的蛋白的抗體(ti)，與(yu)靶(ba)蛋白-DNA復合(he)物相(xiang)互(hu)結合(he)---加(jia)入(ru)ProteinA，結合(he)抗體(ti)-靶(ba)蛋白-DNA復合(he)物，並沈澱(dian)---對沈澱(dian)下(xia)來(lai)的復合(he)物進行(xing)清洗，除去(qu)壹(yi)些非特異(yi)性(xing)結合(he)---洗脫(tuo)，得到(dao)富集(ji)的靶(ba)蛋白-DNA復合(he)物---解(jie)交(jiao)聯(lian)，純化(hua)富集(ji)的DNA-片斷(duan)---PCR分析。