大(da)鼠骨(gu)骼(ge)肌細(xi)胞(bao)培(pei)養技術指南(nan)-從(cong)原代(dai)取(qu)材(cai)到(dao)分化鑒(jian)定

骨(gu)骼(ge)肌是(shi)壹(yi)種橫紋肌，通(tong)常(chang)是通(tong)過肌腱(jian)固(gu)定到(dao)骨(gu)骼(ge)上，其伸縮(suo)可(ke)以帶動骨(gu)骼(ge)的(de)移(yi)動，促進(jin)機體運動。

    肌細(xi)胞(bao)呈(cheng)纖維狀(zhuang)，不(bu)分支，有明顯(xian)橫紋，核(he)很多(duo)，且都位(wei)於細(xi)胞(bao)膜下方。肌細(xi)胞(bao)內(nei)有許多(duo)沿(yan)細(xi)胞(bao)長軸平行排(pai)列(lie)的(de)細(xi)絲(si)狀(zhuang)肌原纖維，每(mei)壹(yi)肌原纖維都有相間(jian)排(pai)列(lie)的(de)粗肌絲(si)及(ji)細(xi)肌絲(si)。肌纖維收(shou)縮(suo)並不是肌纖維中肌絲(si)本身的(de)縮(suo)短(duan)或(huo)卷曲(qu)，而(er)是細(xi)肌絲(si)在(zai)粗肌絲(si)之(zhi)間(jian)滑(hua)行的(de)結果(guo)，肌絲(si)滑(hua)行使肌節長度縮(suo)短(duan)，肌原纖維縮(suo)短(duan)表現為(wei)肌纖維收(shou)縮(suo)。

壹(yi)、實驗(yan)前(qian)準備

實驗(yan)開(kai)始前，將(jiang)眼科剪(jian)刀(dao)、眼科鑷(nie)子(zi)、培(pei)養皿(min)，15ml 離心(xin)管、移(yi)液管(guan)、移液槍(qiang)、槍(qiang)頭(tou)等放入無菌超(chao)凈(jing)工作臺，以紫(zi)外(wai)線(xian)照射(she) 30min。

按(an)照含 0.2%的(de) XI 膠(jiao)原酶、0.2%的(de)中性(xing)蛋白(bai)酶、0.1%的(de)膠(jiao)原酶進(jin)行配(pei)制消(xiao)化液，用(yong)0.22微米的 PES 微(wei)孔(kong)濾(lv)膜進(jin)行過濾(lv)除菌，置(zhi)於(yu) 50 毫(hao)升(sheng)離心(xin)管中(zhong)，可(ke)直接用於組織消化。瓶(ping)口消毒(du)後(hou)室(shi)溫(wen)待用(yong)。

取(qu)出無(wu)菌培(pei)養皿(min)，分(fen)別(bie)作好標記，吸(xi)取(qu)適(shi)量 PBS 置(zhi)於相應標記的(de)培(pei)養皿(min)中(zhong)。

無(wu)菌條(tiao)件(jian)下，準(zhun)備好各種大小(xiao)的(de)眼(yan)科(ke)剪(jian)刀、止血鉗(qian)、眼科鑷子(zi)和手(shou)術(shu)刀。將(jiang)斷(duan)頸處(chu)死(si)後浸(jin)泡於體(ti)積分數為 75%乙醇(chun)的(de)SD 大(da)鼠(shu)仰臥在(zai)超凈(jing)臺內(nei)的幹凈(jing)培(pei)養皿(min)上。

二、骨(gu)骼(ge)肌提(ti)取(qu)

眼科(ke)剪刀剪開大(da)鼠後(hou)肢皮(pi)膚(fu)，暴露腿部(bu)肌肉(rou)，用(yong)手術(shu)刀小(xiao)心(xin)割(ge)取(qu)後(hou)肢大腿肌肉(rou)，同樣方法分離另(ling)壹(yi)後肢(zhi)大(da)腿肌肉(rou)。小(xiao)心(xin)剪(jian)取(qu)表面(mian)無(wu)附著(zhe)膜和脂(zhi)肪(fang)組織的肌肉(rou)，置(zhi)於裝(zhuang)有 PBS 的無菌培(pei)養皿(min)中(zhong)。

吸(xi)取(qu)適(shi)量消(xiao)化液於(yu)相應標記的(de)培(pei)養皿(min)中(zhong)。

將(jiang)剪(jian)取的骨(gu)骼(ge)肌在(zai)無菌 PBS 浸(jin)泡清洗(xi)，去(qu)除(chu)脂(zhi)肪(fang)組織後放置於含消(xiao)化液的(de)培(pei)養皿(min)中(zhong)，采(cai)用(yong)眼科剪刀剪(jian)碎骨(gu)骼(ge)肌組織，成(cheng) 1 平方毫(hao)米不規(gui)則(ze)碎片(pian)。

輕輕搖勻(yun)，室(shi)溫(wen)靜置(zhi)消(xiao)化 30 分(fen)鐘

收(shou)集組織懸(xuan)液於(yu) 50 毫(hao)升(sheng)離心(xin)管中(zhong)，用(yong)消化液反(fan)復沖(chong)洗(xi)培(pei)養皿(min)，直至(zhi)將全(quan)部組織塊(kuai)收(shou)集到(dao)離心(xin)管內(nei)。

輕輕吹(chui)打混勻組織塊(kuai)懸(xuan)浮液.

配(pei)平離心(xin)：使用(yong)低(di)速(su)離心(xin)機每(mei)分(fen)鐘(zhong) 1000 轉，室(shi)溫(wen)離心(xin)十(shi)分鐘(zhong)。

三(san)、骨(gu)骼(ge)肌懸(xuan)液制(zhi)備及(ji)培(pei)養

離心(xin)後小(xiao)心(xin)去(qu)除(chu)上清(qing)，不要(yao)吸到底部(bu)的組織塊(kuai)沈(chen)澱，用(yong)含 20%胎牛(niu)血(xue)清(qing)的 DMEM 培(pei)養基(ji)重(zhong)懸(xuan)，輕輕吹(chui)打混勻，制(zhi)成(cheng)懸(xuan)液。

均勻(yun)轉移至(zhi)六孔板中(zhong)，輕輕搖勻(yun)，標記時(shi)間(jian)後(hou)放於 37 ℃、體積分數為 5%的CO2 飽和濕(shi)度(du)培(pei)養箱(xiang)中(zhong)培(pei)養。

本次(ci)實驗(yan)采(cai)用差(cha)速(su)貼壁(bi)法去除(chu)成(cheng)纖維細(xi)胞(bao),37 ℃培(pei)養 1 小(xiao)時(shi) 後(hou)，吸(xi)取(qu)上清(qing)液置(zhi)於另(ling)壹(yi)孔中(zhong)繼(ji)續(xu)培(pei)養。

每(mei)隔(ge)壹(yi)小(xiao)時(shi)轉移壹(yi)次(ci)，轉移 3-4 次(ci)。4 天(tian)後(hou)換(huan)液, 以後每(mei)天(tian)換(huan)液 1 次(ci)，直到增(zeng)殖(zhi)達(da)到(dao)融(rong)合(he)。

四、細(xi)胞(bao)觀察(cha)及鑒(jian)定

差(cha)速(su)培(pei)養後，細(xi)胞(bao) 24 小(xiao)時(shi)後(hou)開(kai)始(shi)貼壁(bi),96 小(xiao)時(shi)後(hou)貼(tie)壁(bi)，倒(dao)置顯微(wei)鏡(jing)下(xia)每(mei)天(tian)觀察(cha)細(xi)胞(bao)生長及形(xing)態(tai)特征，傳(chuan)代(dai)培(pei)養純化至(zhi) P3 代(dai)用(yong)於(yu)後(hou)續試驗。

采用 HE 染(ran)色(se)和a-actin 染(ran)色(se)進(jin)行骨(gu)骼(ge)肌細(xi)胞(bao)鑒(jian)定。

結果(guo)表明(ming)：本實驗(yan)所(suo)用的(de)消(xiao)化液以及差(cha)速(su)貼壁(bi)法可(ke)分離培(pei)養出純(chun)度高、活(huo)力(li)旺盛的(de)骨(gu)骼(ge)肌細(xi)胞(bao)。

五、註(zhu)意事(shi)項(xiang)

1、消化液的(de)制備及(ji)消(xiao)化時(shi)間(jian)

合(he)適(shi)的消(xiao)化液以及消化時(shi)間(jian)的(de)把握, 是實驗(yan)取(qu)材的關(guan)鍵：

合(he)適(shi)的消(xiao)化液利(li)於骨(gu)骼(ge)肌細(xi)胞(bao)從基(ji)膜(mo)中(zhong)釋放出來(lai)。

酶作用時間(jian)不(bu)足則(ze)獲(huo)得(de)細(xi)胞(bao)較少,作用時間(jian)過長則(ze)可(ke)致細(xi)胞(bao)受損(sun)、生長狀(zhuang)態(tai)不佳(jia)。

2、肌肉(rou)組織要盡可(ke)能剔除表面(mian)的(de)膜(mo)和脂(zhi)肪(fang)組織：

肌肉(rou)組織表明(ming)的(de)膜(mo)和脂(zhi)肪(fang)組織去除利(li)於(yu)後(hou)續細(xi)胞(bao)的純化，減少傳(chuan)代(dai)次(ci)數，獲(huo)得(de)純度高的骨(gu)骼(ge)肌細(xi)胞(bao)。

3、纖維細(xi)胞(bao)的去除(chu) :

本實驗(yan)采(cai)用差(cha)速(su)貼壁(bi)法去除(chu)成(cheng)纖維細(xi)胞(bao),37 ℃培(pei)養 1 小(xiao)時(shi)後(hou)移(yi)至(zhi)另壹(yi)孔進(jin)行培(pei)養。

轉移兩(liang)次(ci)，有(you)效(xiao)去(qu)除(chu)骨(gu)骼(ge)肌細(xi)胞(bao)中的成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)。

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