質粒(li)DNA酶(mei)切(qie)實(shi)驗指(zhi)南

壹(yi)、實(shi)驗目(mu)的(de)：

檢(jian)測重組(zu)質粒(li)是否(fou)成(cheng)功，外(wai)源(yuan)片段(duan)是否(fou)正(zheng)確插(cha)入(ru)到(dao)質粒(li)載(zai)體中。

二、實(shi)驗原(yuan)理：

限制(zhi)性核(he)酸內切酶(mei)是可(ke)以(yi)識別DNA的(de)特(te)異(yi)序列(lie)，並在識別位點或(huo)其(qi)周圍(wei)切割(ge)雙(shuang)鏈DNA的(de)壹(yi)類內切酶(mei)。按(an)限制(zhi)酶(mei)的(de)組(zu)成(cheng)、與修飾(shi)酶(mei)活(huo)性關系以(yi)及(ji)切斷核(he)酸的(de)情(qing)況(kuang)不(bu)同(tong)，分為三類(lei)： 第壹(yi)類（I型）限制(zhi)性內切酶(mei)、第二類（II型）限制(zhi)性內切酶(mei)和第三類(lei)（ III型）限制(zhi)性內切酶(mei)。

現在商業(ye)化(hua)的(de)內切酶(mei)壹(yi)般都是II型限制(zhi)性內切酶(mei)，具(ju)有(you)以(yi)下三個(ge)特(te)點：

1. 識別位點的(de)特(te)異(yi)性：每種(zhong)酶(mei)都有(you)其(qi)特(te)定的(de) DNA識別位點，通(tong)常是由 4，5，6或 7甚(shen)至更(geng)多個(ge)核(he)苷酸(suan)組(zu)成(cheng)的(de)特(te)定序列(lie)（靶序(xu)列(lie)）。

2. 識別序(xu)列(lie)的(de)對(dui)稱性：靶序(xu)列(lie)通常具(ju)有(you)雙(shuang)重(zhong)旋(xuan)轉對(dui)稱的(de)結(jie)構，即(ji)雙(shuang)鏈的(de)核(he)苷酸(suan)順(shun)序呈(cheng)回(hui)文結(jie)構。識別序(xu)列(lie)有壹(yi)個(ge)中心(xin)對(dui)稱軸(zhou)，從(cong)這個(ge)軸(zhou)朝(chao)二個(ge)方向(xiang)“讀(du)"都相(xiang)同(tong)。

如(ru)EcoRI的(de)識別順(shun)序為：

5'…… GAA|TTC ……3'

3'…… CTT|AAG …… 5'

垂直(zhi)線表示中心(xin)對(dui)稱軸(zhou)，從(cong)兩(liang)側“讀"核(he)苷酸(suan)順(shun)序都是GAATTC或(huo)CTTAAG。

3. 切割(ge)位點的(de)規(gui)範(fan)性： 雙(shuang)鏈 DNA被(bei)酶(mei)切(qie)後，可形(xing)成(cheng)粘性末端(duan)或(huo)平(ping)末(mo)端(duan)DNA分(fen)子。
粘性末端(duan)：交(jiao)錯切割(ge)，結(jie)果(guo)形(xing)成(cheng)兩條(tiao)單鏈末端(duan)，這種(zhong)末(mo)端(duan)的(de)核(he)苷酸(suan)順(shun)序是互(hu)補的(de)，可(ke)形(xing)成(cheng)氫(qing)鍵。

如(ru)EcoRI的(de)識別順(shun)序為：

5'…… G'AA|TT_C ……3'

3'…… C_TT|AA'G …… 5'

_和'表示在雙(shuang)鏈上交(jiao)錯切(qie)割(ge)的(de)位置(zhi)，切割(ge)後(hou)生(sheng)成(cheng)5'G………  5'.AATTC，3'CTTAA.和3'……...G二個(ge)DNA片段(duan)，各(ge)有壹(yi)個(ge)單鏈末端(duan)，二條(tiao)單鏈是互(hu)補的(de)，其(qi)斷裂(lie)的(de)磷酸(suan)二酯鍵以(yi)及(ji)氫(qing)鍵可通過DNA連(lian)接酶(mei)的(de)作(zuo)用而(er)“粘(zhan)合(he)"。　　　　　

平(ping)頭(tou)末端(duan)：在同(tong)壹(yi)位置(zhi)上切(qie)割(ge)雙(shuang)鏈，產(chan)生平(ping)頭(tou)末端(duan)。

如(ru)EcoRV 的(de)識別位置(zhi)是： 

5'…… GAT'|ATC …… 3'

3'…… CTA'|TAG …… 5' 　

'表示在雙(shuang)鏈上交(jiao)錯切(qie)割(ge)的(de)位置(zhi)，切割(ge)後(hou)形(xing)成(cheng)5'…… GAT   ATC …… 3'和3'……CTA和 TAG……5'二個(ge)片段(duan)，這種(zhong)末(mo)端(duan)同(tong)樣可以(yi)通(tong)過DNA連(lian)接酶(mei)連(lian)接起來(lai)。

三、實(shi)驗試(shi)劑(ji)：

1. 質粒(li)DNA

2. 酶(mei)切(qie)緩沖(chong)液（TaKaRa）

3. 限制(zhi)性內切酶(mei)（TaKaRa）

4. ddH₂O

5. TAE電(dian)泳緩沖(chong)液

6. 瓊脂(zhi)糖(tang)

四、實(shi)驗步(bu)驟：

1. 在微(wei)量(liang)離心(xin)管(guan)中配(pei)置(zhi)如(ru)下酶(mei)切(qie)體系：

2. 適(shi)宜溫度反(fan)應3小時(shi)。

3. 瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝膠電泳(yong)檢測。

五(wu)、註(zhu)意事(shi)項(xiang):

1. 質粒(li)酶(mei)切(qie)所(suo)用緩(huan)沖(chong)液參照試(shi)劑(ji)目(mu)錄選(xuan)擇。單(dan)酶(mei)切(qie)選用產(chan)品(pin)附帶(dai)的(de)緩(huan)沖(chong)液，雙(shuang)酶(mei)切(qie)根(gen)據試劑(ji)目錄(lu)選(xuan)擇最(zui)適(shi)緩(huan)沖(chong)液。

2. 壹(yi)般1 μg質粒(li)至(zhi)少(shao)加(jia)1 U酶(mei)，酶(mei)切(qie)體系中酶(mei)的(de)體積(ji)不超(chao)過1/10。

3. 根(gen)據試劑(ji)目錄(lu)選(xuan)擇最(zui)適(shi)酶(mei)切(qie)溫度。 

更(geng)多(duo)實(shi)驗室(shi)內切酶(mei)相(xiang)關試劑請進入(ru)蘇(su)州(zhou)阿爾法(fa)生物進行了(le)解(jie)。