人(ren)腸(chang)道類器(qi)官(guan)構建的(de)核(he)心(xin)：腸道(dao)幹(gan)細(xi)胞的(de)高效分離與培養技(ji)術(shu)要點(dian)

人(ren)腸(chang)道類器(qi)官(guan)作為壹(yi)種在體外高度(du)模(mo)擬人(ren)體腸道(dao)結(jie)構和功能(neng)的(de)三維(wei)模(mo)型，在疾(ji)病(bing)建模(mo)、藥物(wu)篩選、宿(xiu)主-微生(sheng)物(wu)互作及再生(sheng)醫(yi)學等領域(yu)展(zhan)現(xian)出(chu)巨大潛力。其(qi)成功(gong)構建的(de)基石(shi)在於(yu)能(neng)否高效、穩定地從(cong)腸道組(zu)織(zhi)中(zhong)分離出(chu)具有(you)幹(gan)性(xing)的(de)隱窩基幹(gan)細(xi)胞。本文系統性(xing)地總(zong)結(jie)人(ren)腸(chang)道類器(qi)官(guan)構建過程(cheng)中(zhong)，從組(zu)織(zhi)獲取(qu)到(dao)幹(gan)細(xi)胞分離、最(zui)終形成類(lei)器(qi)官(guan)的(de)關鍵技(ji)術(shu)要點(dian)、常見問(wen)題及解(jie)決(jue)方(fang)案(an)，為(wei)相(xiang)關研究提供(gong)實踐(jian)參考。

   腸(chang)道(dao)上(shang)皮(pi)是壹(yi)個持(chi)續(xu)更新的(de)動(dong)態(tai)系統，其再生(sheng)能(neng)力源於(yu)位於(yu)腸隱(yin)窩基底部(bu)的(de)Lgr5+腸道(dao)幹(gan)細(xi)胞。2009年，Clevers團隊開(kai)創(chuang)性(xing)地在體外利(li)用(yong)單個Lgr5+幹(gan)細(xi)胞成功(gong)培育出具(ju)有(you)隱(yin)窩-絨毛結(jie)構的(de)腸道(dao)類(lei)器(qi)官(guan)，標誌(zhi)著該(gai)領(ling)域(yu)的(de)重(zhong)大突(tu)破。這(zhe)壹(yi)技(ji)術(shu)的(de)核(he)心(xin)在於(yu)：從人(ren)腸(chang)道組織(zhi)中(zhong)分離出(chu)完(wan)整的(de)隱窩單元或(huo)活性(xing)幹(gan)細(xi)胞，並將其置(zhi)於(yu)能(neng)模(mo)擬體內幹(gan)細(xi)胞巢（Niche）的(de)基質(zhi)膠(jiao)中(zhong)，提供(gong)必需(xu)的(de)生(sheng)長(chang)因子信(xin)號。

壹(yi)、 技(ji)術(shu)流(liu)程(cheng)與核(he)心(xin)要點(dian)

整個流(liu)程(cheng)可大致(zhi)分為(wei)：組(zu)織(zhi)前處理、隱(yin)窩/幹(gan)細(xi)胞分離、類(lei)器(qi)官(guan)培養與傳(chuan)代。每壹(yi)步的(de)精(jing)細(xi)操(cao)作都直(zhi)接影(ying)響最(zui)終的(de)成敗。

1. 組織(zhi)樣本的(de)前處理與準(zhun)備(bei)

技(ji)術(shu)要點(dian)：

• 樣本來(lai)源與運輸： 樣本可(ke)來源於(yu)手(shou)術(shu)切除(chu)的(de)健康或(huo)病(bing)變腸段(duan)、內(nei)鏡(jing)活檢(jian)組織(zhi)。關鍵在於(yu)保持(chi)組(zu)織(zhi)活性(xing)。離體後應立即置(zhi)於(yu)預冷的(de)（4°C）組織(zhi)保存(cun)液（如含有(you)高濃(nong)度(du)抗生(sheng)素(su)的(de)Advanced DMEM/F12）中(zhong)，並在最(zui)短時間(jian)內（建(jian)議<24小時）進(jin)行(xing)處理。冰(bing)上(shang)操(cao)作以(yi)降(jiang)低代(dai)謝(xie)。

• 組織(zhi)清洗與修(xiu)剪： 用含有(you)多(duo)重(zhong)抗生(sheng)素(su)（如青(qing)黴(mei)素/鏈(lian)黴(mei)素、慶大黴(mei)素、兩性(xing)黴(mei)素B等）的(de)PBS或(huo)Advanced DMEM/F12充分沖洗，直(zhi)至(zhi)清洗液清澈，以(yi)去(qu)除(chu)黏(nian)液和內(nei)容(rong)物。隨(sui)後，使用精(jing)細(xi)解(jie)剖工具小心(xin)去除(chu)腸壁的(de)肌(ji)肉(rou)層(ceng)和脂(zhi)肪組(zu)織(zhi)，僅(jin)保留黏(nian)膜層(ceng)。這(zhe)壹(yi)步能(neng)極(ji)大減少(shao)後續的(de)微生(sheng)物(wu)汙染(ran)和(he)成纖(xian)維(wei)細(xi)胞過度(du)生(sheng)長(chang)。

• 黏(nian)膜剝離： 將(jiang)修(xiu)剪後的(de)黏(nian)膜組(zu)織(zhi)剪成約0.5 cm²的(de)小塊(kuai)，便(bian)於(yu)後續消(xiao)化。

2. 隱(yin)窩與幹(gan)細(xi)胞的(de)分離

這(zhe)是整個流(liu)程(cheng)中(zhong)最(zui)關鍵、技(ji)術(shu)性(xing)的(de)環節(jie)，主要方(fang)法(fa)有(you)化(hua)學消(xiao)化法(fa)和物(wu)理分離法(fa)。

A. 化學(xue)消(xiao)化法(fa)（常用(yong)）

• 原(yuan)理： 利(li)用(yong)螯(ao)合劑(ji)和(he)酶選擇(ze)性(xing)解(jie)離細(xi)胞間(jian)連(lian)接，釋放隱窩結(jie)構。

• 關鍵試劑(ji)： EDTA (乙(yi)二(er)胺四(si)乙(yi)酸) 是(shi)核(he)心(xin)。它通(tong)過螯(ao)合Ca²⁺和Mg²⁺，破(po)壞依賴(lai)於(yu)二(er)價陽(yang)離子(zi)的(de)細(xi)胞黏(nian)附(fu)分子(zi)（如(ru)E-cadherin），從(cong)而(er)松(song)解(jie)隱窩單元。

• 標準(zhun)流(liu)程(cheng)與要點(dian)：

1. EDTA孵(fu)育： 將組(zu)織(zhi)碎片置(zhi)於(yu)含2-30 mM EDTA的(de)PBS溶液中(zhong)（常用(yong)濃(nong)度(du)為5-10 mM），在4°C下(xia)緩(huan)慢(man)搖(yao)動(dong)孵(fu)育30分鐘(zhong)至(zhi)2小(xiao)時(shi)。低(di)溫(wen)孵育有(you)助(zhu)於(yu)溫和(he)解(jie)離，減(jian)少對(dui)幹(gan)細(xi)胞的(de)損傷(shang)。

2. 機械(xie)震蕩(dang)： 孵育後，用力搖(yao)晃(huang)試管或(huo)使用大口徑吸管反復(fu)吹(chui)打(da)。此時，隱(yin)窩應從黏(nian)膜上(shang)脫落(luo)，懸(xuan)液變得渾(hun)濁(zhuo)。

3. 洗滌(di)與收(shou)集(ji)： 使用預冷的(de)PBS或(huo)基礎(chu)培養基洗滌(di)細(xi)胞懸液，通過(guo)100 μm細(xi)胞篩過濾以(yi)去(qu)除(chu)大塊(kuai)組(zu)織(zhi)。濾液需再(zai)次(ci)通過(guo)40 μm細(xi)胞篩，此時(shi)完(wan)整的(de)隱窩（通常>40 μm）會(hui)被截(jie)留(liu)在篩網上(shang)，而(er)單個細(xi)胞和碎片則被(bei)濾除。

4. 顯微鏡下確(que)認： 收(shou)集(ji)40 μm篩網上(shang)的(de)物質(zhi)，重(zhong)懸後於(yu)倒(dao)置(zhi)顯微鏡下觀(guan)察。成功(gong)的(de)分離應(ying)看(kan)到(dao)大量形態完(wan)整、呈(cheng)“花瓶狀(zhuang)"或(huo)“戒指狀"的(de)隱窩結(jie)構，輪廓清晰，內部(bu)細(xi)胞緊密(mi)。碎片和單(dan)個細(xi)胞應盡(jin)可(ke)能(neng)少(shao)。

B. 隱窩富集與純化(hua)

• 目的(de)： 進(jin)壹(yi)步提高隱窩的(de)純度(du)，去除(chu)殘留的(de)單個細(xi)胞（多為(wei)分化(hua)的(de)上(shang)皮(pi)細(xi)胞或(huo)免(mian)疫細(xi)胞）和死細(xi)胞。

• 技(ji)術(shu)：

• 自然沈(chen)降(jiang)法(fa)： 利用(yong)隱(yin)窩與單個細(xi)胞沈(chen)降(jiang)速(su)度(du)的(de)差異，將(jiang)細(xi)胞懸液靜(jing)置(zhi)於(yu)冰上(shang)5-10分鐘(zhong)，小(xiao)心(xin)吸取(qu)上(shang)清（含較多單(dan)個細(xi)胞和碎片），重(zhong)復(fu)2-3次(ci)。

• 密(mi)度(du)梯(ti)度(du)離心(xin)法(fa)： 使用如(ru)Percoll等密(mi)度(du)梯(ti)度(du)離心(xin)介質(zhi)，可(ke)以(yi)更(geng)精(jing)細(xi)地分離出(chu)高純度(du)的(de)隱窩。

3. 類器(qi)官(guan)的(de)培養與維(wei)持(chi)

技(ji)術(shu)要點(dian)：

• 基質(zhi)膠(jiao)包埋(mai)： 將收(shou)集(ji)到(dao)的(de)隱窩與預冷的(de)基質(zhi)膠(jiao)（如(ru)Matrigel®或(huo)Cultrex BME）充分重(zhong)懸。關鍵：所有(you)操(cao)作必須在冰(bing)上(shang)進(jin)行(xing)，以(yi)防(fang)止(zhi)基質(zhi)膠(jiao)提(ti)前聚合。 

• 以(yi)每滴(di)20-50 μL的(de)體積將(jiang)膠(jiao)滴(di)加至(zhi)培養板(ban)孔中(zhong)，隨(sui)後在37°C下(xia)孵育15-30分鐘(zhong)，使其固(gu)化(hua)。

• 類(lei)器(qi)官(guan)培養基： 在固(gu)化(hua)的(de)基質(zhi)膠(jiao)上(shang)覆蓋(gai)富(fu)含生(sheng)長(chang)因子的(de)類器(qi)官(guan)培養基。核(he)心(xin)生(sheng)長(chang)因子組合包括：

• Wnt3a： 維(wei)持(chi)幹(gan)細(xi)胞自我更新的(de)關鍵信(xin)號。

• R-spondin 1： 增強Wnt信(xin)號通路。

• Noggin： BMP信(xin)號通路抑(yi)制劑(ji)，促(cu)進(jin)隱(yin)窩形態發生(sheng)。

• EGF： 刺(ci)激(ji)上(shang)皮(pi)細(xi)胞增殖。

• 此外(wai)，還需添加B27、N2等補充(chong)劑(ji)，以(yi)及(ji)如(ru)Gastrin、Nicotinamide等小分子(zi)。

• 培養環(huan)境： 置(zhi)於(yu)37°C、5% CO₂的(de)恒溫培養箱中(zhong)。培養基需每2-3天(tian)更換(huan)壹(yi)次(ci)，以(yi)保持(chi)生(sheng)長(chang)因子活性(xing)和營(ying)養供(gong)給。

4. 類器(qi)官(guan)的(de)傳(chuan)代與擴(kuo)增

當類器(qi)官(guan)生(sheng)長(chang)至(zhi)中(zhong)心(xin)區域(yu)變暗、充(chong)滿(man)細(xi)胞時（通(tong)常(chang)培養後5-10天(tian)），需要(yao)進(jin)行(xing)傳(chuan)代。

• 消(xiao)化： 使用機(ji)械吹(chui)打(da)或(huo)溫和(he)的(de)消(xiao)化酶(mei)（如(ru)Accutase、TrypLE）將類器(qi)官(guan)和基質(zhi)膠(jiao)消(xiao)化成單(dan)個細(xi)胞或(huo)小的(de)細(xi)胞團塊(kuai)。

• 重(zhong)懸與再鋪板(ban)： 將消(xiao)化後的(de)細(xi)胞懸液按適(shi)當(dang)比(bi)例（通常(chang)1:3至(zhi)1:6）與新的(de)基質(zhi)膠(jiao)混合，開(kai)始(shi)新壹(yi)輪的(de)培養。

二(er)、 常見(jian)問(wen)題與優化(hua)策(ce)略

高效分離具(ju)有(you)完(wan)整功(gong)能(neng)的(de)人(ren)腸(chang)道幹(gan)細(xi)胞是成功(gong)構建類器(qi)官(guan)的(de)前提。掌(zhang)握從(cong)組織(zhi)處理、EDTA溫(wen)和(he)消(xiao)化到(dao)隱(yin)窩純化等壹(yi)系列(lie)關鍵技(ji)術(shu)細(xi)節(jie)，是(shi)獲得高活性(xing)、高純度(du)幹(gan)細(xi)胞群的(de)決(jue)定性(xing)因素。隨(sui)著技(ji)術(shu)的(de)不(bu)斷進(jin)步，如利用流(liu)式細(xi)胞術(shu)或(huo)特定的(de)實驗室(shi)儀(yi)器(qi)分選(xuan)特(te)定標誌(zhi)物(wu)（如(ru)CD24, CD44）的(de)幹(gan)細(xi)胞亞群，或(huo)通過(guo)非整合性(xing)重(zhong)編(bian)程(cheng)手(shou)段(duan)獲得誘(you)導性(xing)多能(neng)幹(gan)細(xi)胞來源的(de)腸道(dao)類(lei)器(qi)官(guan)，將進(jin)壹(yi)步拓(tuo)寬(kuan)該(gai)技(ji)術(shu)的(de)應用(yong)邊界。對(dui)技(ji)術(shu)要點(dian)的(de)深刻理解(jie)和不(bu)斷優化，將是(shi)推動(dong)人(ren)腸(chang)道類器(qi)官(guan)技(ji)術(shu)在基礎(chu)研究與科研(yan)應(ying)用中(zhong)發揮(hui)更大價值(zhi)的(de)關鍵。