Transwell細胞(bao)遷移實(shi)驗(yan)的(de)詳(xiang)細操(cao)作(zuo)和避(bi)坑(keng)指(zhi)南

作(zuo)為每天(tian)要幫(bang)實(shi)驗(yan)室客(ke)戶解決各(ge)種(zhong) Transwell 問(wen)題的(de)實(shi)驗(yan)耗(hao)材供應(ying)商(shang)，我見過(guo)太(tai)多(duo)同(tong)學(xue)因(yin)為操(cao)作(zuo)細節(jie)沒把控(kong)好，明明(ming)細胞(bao)狀態沒(mei)問(wen)題，最後(hou)卻得不到(dao)能用(yong)的(de)數(shu)據 —— 要麽(me)膜上(shang)細胞(bao)太(tai)少，要麽(me)下室細胞(bao)汙染(ran)，甚(shen)至(zhi)連 Transwell 小(xiao)室怎麽(me)放都(dou)能搞(gao)錯。

其實(shi)細胞(bao)遷移實(shi)驗(yan)本(ben)身(shen)不復(fu)雜(za)，但90% 的(de)失敗都(dou)藏(zang)在(zai) “不起(qi)眼(yan)" 的(de)細節(jie)裏。今天(tian)就(jiu)從(cong) “耗材準(zhun)備 - 細胞(bao)處(chu)理 - 實(shi)驗(yan)操(cao)作(zuo) - 結果統(tong)計(ji)" 全流程(cheng)，把我總(zong)結(jie)的(de)實(shi)操(cao)要點和避(bi)坑(keng)經驗(yan)分(fen)享(xiang)給大家(jia)，新(xin)手照(zhao)著做(zuo)，基本能壹次(ci)出(chu)有(you)效(xiao)數(shu)據。

壹、實(shi)驗(yan)前(qian)：耗材和試(shi)劑準(zhun)備，這(zhe)些(xie) “預(yu)處(chu)理" 別(bie)省

很多(duo)人(ren)拿(na)到(dao) Transwell 小(xiao)室就(jiu)直接用，其實(shi)第壹步(bu) “預(yu)處(chu)理" 沒(mei)做(zuo)好，後續(xu)再(zai)努(nu)力(li)也白(bai)費(fei)。先(xian)明(ming)確(que)：我們(men)常(chang)用的(de) Transwell 小(xiao)室（遷移實(shi)驗(yan)用(yong)無(wu)基質膠的(de)，侵襲(xi)實(shi)驗(yan)才(cai)加(jia) Matrigel），核(he)心(xin)是(shi)聚碳酸酯膜（孔(kong)徑壹般(ban)選 8μm，除(chu)非(fei)細胞(bao)特別(bie)大 / 小(xiao)，比如神經元可能用(yong) 12μm），實(shi)驗(yan)耗(hao)材膜的(de)處(chu)理和(he)試(shi)劑配(pei)比是(shi)關(guan)鍵(jian)。

1. Transwell 小(xiao)室的(de)預處(chu)理：別(bie)讓(rang) “氣(qi)泡" 毀了(le)實(shi)驗(yan)

• 第壹步(bu)：激(ji)活膜(mo)的(de)親水性

新的(de)小(xiao)室膜是(shi)疏水(shui)的(de)，細胞(bao)沒(mei)法(fa)附著遷移，必(bi)須(xu)先(xian)用(yong)水或培(pei)養基浸(jin)潤激活。操(cao)作(zuo)時用(yong)無(wu)菌(jun)槍(qiang)頭(tou)吸取(qu)無(wu)血清(qing)培(pei)養基（或 PBS），緩慢(man)加(jia)到(dao)小(xiao)室內(nei)部(bu)（膜上(shang)方），註意別(bie)戳(chuo)到(dao)膜！加(jia)完(wan)後放(fang)在(zai)培(pei)養板(ban)孔(kong)裏(li)，室溫(wen)靜(jing)置(zhi) 20-30 分(fen)鐘(zhong)，讓(rang)膜充(chong)分吸水變(bian)親水。

✅ 避(bi)坑(keng)：別(bie)用(yong)血清(qing)培(pei)養基激活！血清(qing)裏的(de)蛋白(bai)會(hui)提前(qian)吸附在(zai)膜上(shang)，反而(er)影響細胞(bao)遷移。

• 第二步(bu)：去(qu)除膜上(shang)殘留液(ye)體(ti)

激活後(hou)，用無(wu)菌(jun)吸頭輕輕吸掉(diao)小(xiao)室內(nei)部(bu)的(de)培(pei)養基（動(dong)作(zuo)要輕，別(bie)把膜(mo)吸破），再(zai)把小(xiao)室倒(dao)扣(kou)在(zai)無菌(jun)濾(lv)紙(zhi)上(shang)吸 10 秒，把膜(mo)上(shang)多(duo)余(yu)的(de)液(ye)體(ti)吸幹 —— 殘(can)留液(ye)體(ti)太(tai)多(duo)，會(hui)導(dao)致(zhi)上(shang)室細胞(bao)懸(xuan)液(ye)被(bei)稀釋(shi)，影響細胞(bao)密度。

2. 試(shi)劑配(pei)比：血清(qing)濃度是(shi) “遷移動(dong)力"，別(bie)亂(luan)加(jia)

Transwell 遷移的(de)原(yuan)理是(shi) “趨化(hua)作(zuo)用"：下室的(de)血清(qing)（營(ying)養(yang)）吸引上(shang)室的(de)細胞(bao)穿(chuan)過(guo)膜(mo)，所(suo)以上(shang)下室的(de)血清(qing)濃度差(cha)是(shi)關(guan)鍵(jian)，配(pei)比錯(cuo)了(le)細胞(bao)根(gen)本(ben)不遷移。

• 上(shang)室：無血清(qing)培(pei)養基（或含 0.1%-0.5% 血清(qing)，避(bi)免(mian)細胞(bao)饑餓過度，但(dan)濃(nong)度絕(jue)對(dui)不能高(gao)於下室）

• 下室：含 10%-20% 血清(qing)的(de)培(pei)養基（根據細胞(bao)類(lei)型(xing)調整(zheng)，比如腫(zhong)瘤細胞(bao)用(yong) 10% 足(zu)夠，成纖維(wei)細胞(bao)可(ke)能需(xu)要 20%）

⚠️ 重點：下室加(jia)培(pei)養基時，要先(xian)加(jia)到(dao)培(pei)養板(ban)孔(kong)裏(li)，再(zai)放(fang)入預處(chu)理好的(de)小(xiao)室，避(bi)免(mian)小(xiao)室下方(fang)產(chan)生氣(qi)泡 —— 氣(qi)泡會(hui)頂住(zhu)膜，細胞(bao)穿(chuan)不過(guo)去(qu)，最後(hou)下室沒細胞(bao)，白(bai)做(zuo)！

二、細胞(bao)處(chu)理：狀態比數(shu)量更(geng)重要，這(zhe) 3 步別(bie)錯(cuo)

很多(duo)同(tong)學(xue)糾(jiu)結(jie) “上(shang)室加(jia)多(duo)少細胞(bao)"，其(qi)實(shi)比數(shu)量更(geng)重要的(de)是(shi)細胞(bao)狀態—— passages 太(tai)多(duo)、有(you)汙染(ran)、貼壁(bi)不牢(lao)的(de)細胞(bao)，遷移能力(li)會(hui)差(cha)很多(duo)，數(shu)據根本不可(ke)信(xin)。

1. 細胞(bao)消(xiao)化(hua)：別(bie)消(xiao)化過度，避(bi)免(mian)損(sun)傷(shang)細胞(bao)膜(mo)

• 用(yong)胰(yi)酶(mei)消化(hua)時，看(kan)到(dao)細胞(bao)邊(bian)緣收(shou)縮(suo)、輕輕吹打(da)能散(san)開(kai)就(jiu)停(ting)，立刻(ke)加(jia)含血清(qing)的(de)培(pei)養基終(zhong)止消(xiao)化(hua)（血清(qing)能中(zhong)和(he)胰酶(mei)）

• 別(bie)用(yong)槍(qiang)頭(tou)猛(meng)吹，避(bi)免(mian)細胞(bao)破(po)裂 —— 破裂的(de)細胞(bao)會(hui)沈(chen)在(zai)膜上(shang)，最後(hou)計數(shu)時會(hui)算成 “遷移細胞(bao)"，導(dao)致(zhi)數(shu)據偏高(gao)。

2. 細胞(bao)計(ji)數(shu)：調整(zheng)濃度，保(bao)證膜(mo)上(shang)細胞(bao)均勻(yun)

• 消(xiao)化後(hou)的(de)細胞(bao)離(li)心(xin)（1000rpm，5 分(fen)鐘），棄上(shang)清(qing)，用無(wu)血清(qing)培(pei)養基重懸（和(he)上(shang)室培(pei)養基壹致(zhi)），吹成單細胞(bao)懸(xuan)液(ye)

• 計(ji)數(shu)後調整(zheng)濃度：壹般(ban)上(shang)室加(jia) 2-5×10⁴個(ge)細胞(bao) / 孔(kong)（24 孔(kong)板(ban)），具體看(kan)細胞(bao)大小(xiao) —— 比如 A549 細胞(bao)小(xiao)，加(jia) 5×10⁴；HCT116 細胞(bao)大，加(jia) 2×10⁴。

✅ 技(ji)巧(qiao)：如果(guo)不確(que)定濃度，先(xian)做(zuo)預實(shi)驗(yan)（比如設(she) 2、4、6×10⁴三(san)個梯度），選(xuan) “24 小(xiao)時後(hou)膜(mo)上(shang)還(hai)有少量未(wei)遷移細胞(bao)，下室有明顯遷移細胞(bao)" 的(de)濃度。

3. 上(shang)室加(jia)樣(yang)：別(bie)讓(rang)細胞(bao)堆積在(zai)中間

• 加(jia)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)時，槍(qiang)頭(tou)貼(tie)著(zhe)小(xiao)室內(nei)壁(bi)緩慢(man)加(jia)（別(bie)直接滴在(zai)膜上(shang)），加(jia)完(wan)後輕輕晃壹下小(xiao)室，讓細胞(bao)均勻(yun)分(fen)布(bu)在(zai)膜上(shang)

• 上(shang)室液(ye)體(ti)體積：24 孔(kong)板(ban)的(de)小(xiao)室，壹般(ban)加(jia) 200μL（別(bie)加(jia)滿(man)，留壹點空間(jian)，避(bi)免(mian)液(ye)體(ti)溢出到(dao)下室）

• 加(jia)完(wan)後把培(pei)養板(ban)放(fang)進孵箱，前(qian) 30 分鐘(zhong)別(bie)碰—— 讓細胞(bao)先(xian)貼(tie)在(zai)膜上(shang)，避(bi)免(mian)移動(dong)導(dao)致(zhi)細胞(bao)聚堆。

三、孵育和染(ran)色(se)：時間(jian)別(bie)亂(luan)定，染(ran)色(se)步驟(zhou)要 “輕"

孵育時間(jian)和(he)染(ran)色(se)方法，直接影響最後(hou)能不能清(qing)晰(xi)計數(shu)，新手常(chang)在(zai)這(zhe)裏踩(cai)坑(keng)。

1. 孵育時間(jian)：根(gen)據細胞(bao)類(lei)型(xing)定(ding)，別(bie)盲目(mu)跟(gen)文獻(xian)

• 大多(duo)數(shu)腫瘤細胞(bao)（如乳(ru)腺(xian)癌(ai)、肺癌(ai)細胞(bao)）孵育 24 小(xiao)時足(zu)夠；成纖維(wei)細胞(bao)遷移快(kuai)，12-16 小(xiao)時就(jiu)夠；內(nei)皮細胞(bao)慢(man)，可能需(xu)要 36 小(xiao)時

• 怎(zen)麽(me)判斷(duan)時間(jian)到(dao)了(le)？可(ke)以在(zai)孵箱裏(li)觀(guan)察(cha)：用顯微(wei)鏡(jing)看(kan)小(xiao)室膜下方(fang)，有明顯細胞(bao)附著就(jiu)可(ke)以終(zhong)止，別(bie)孵育太(tai)久 —— 否(fou)則(ze)下室細胞(bao)太(tai)多(duo)，會(hui)重疊在(zai)壹起(qi)，沒(mei)法計數(shu)。

2. 固定和染(ran)色(se)：別(bie)把膜(mo)弄(nong)破，別(bie)漏染(ran)

• 第壹步(bu)：棄(qi)液(ye)

取(qu)出(chu)小(xiao)室，先(xian)倒(dao)掉(diao)上(shang)室的(de)培(pei)養基，再用 PBS 輕輕洗 2 次(ci)（別(bie)用(yong)勁沖(chong)，避(bi)免(mian)把膜(mo)上(shang)的(de)細胞(bao)沖(chong)掉(diao)）

• 第二步(bu)：固定

用(yong) 4% 多(duo)聚甲(jia)醛（PFA）加(jia)滿(man)上(shang)室，室溫(wen)固定 20 分鐘(zhong)（固(gu)定是(shi)為了(le)讓(rang)細胞(bao)貼(tie)在(zai)膜上(shang)，後續(xu)染(ran)色(se)不會(hui)掉(diao)）

• 第三(san)步：染(ran)色(se)

棄掉(diao) PFA，用(yong) PBS 洗 2 次(ci)，然後加(jia) 0.1% 結(jie)晶(jing)紫(zi)染(ran)液(ye)（過(guo)濾後(hou)用，避(bi)免(mian)有雜(za)質），室溫(wen)染(ran) 15-20 分鐘 —— 結(jie)晶紫(zi)是(shi)細胞(bao)核(he)染(ran)色(se)，顏(yan)色(se)深(shen)，計(ji)數(shu)清(qing)晰(xi)。

✅ 避(bi)坑(keng)：染(ran)色(se)後壹定(ding)要用(yong) PBS 輕輕洗去(qu)多(duo)余(yu)染(ran)液(ye)，直到(dao)洗出(chu)的(de)水變(bian)清(qing) —— 否(fou)則(ze)背景(jing)顏(yan)色(se)太(tai)深(shen)，細胞(bao)和(he)膜(mo)分(fen)不清(qing)。

3. 擦去(qu)上(shang)室未(wei)遷移細胞(bao)：這(zhe)步是(shi) “數(shu)據準(zhun)確(que)" 的(de)關(guan)鍵(jian)

• 染(ran)色(se)後，用無菌(jun)棉(mian)簽(qian)（或細胞(bao)刮(gua)子(zi)）輕輕擦去(qu)小(xiao)室上(shang)表面(mian)的(de)細胞(bao)（這(zhe)些(xie)是(shi)沒遷移過(guo)去(qu)的(de)），擦的(de)時候(hou)要順(shun)著(zhe)壹個(ge)方(fang)向(xiang)，別(bie)來回(hui)蹭(ceng) —— 避(bi)免(mian)把膜(mo)擦破(po)，或者把下表(biao)面的(de)遷移細胞(bao)擦掉(diao)。

• 擦完(wan)後可(ke)以在(zai)顯微(wei)鏡(jing)下看(kan)壹眼(yan)：上(shang)表面(mian)沒(mei)殘留細胞(bao)，下表(biao)面有紫(zi)色(se)的(de)細胞(bao)，就(jiu)說明(ming)擦幹(gan)凈(jing)了(le)。

四、結果(guo)統(tong)計：別(bie)只(zhi)數(shu) 1 個視(shi)野，這(zhe)樣才(cai)客(ke)觀(guan)

很多(duo)人(ren)隨(sui)便(bian)找個視(shi)野數(shu)細胞(bao)，最後(hou)數(shu)據波(bo)動(dong)大，審稿(gao)人(ren)根(gen)本不認(ren)可(ke)。正確(que)的(de)統計(ji)方法，要保(bao)證 “隨(sui)機性" 和 “重復(fu)性"。

1. 拍照(zhao)：選 5 個(ge)固(gu)定(ding)視(shi)野，避(bi)免(mian)主觀選擇(ze)

• 這(zhe)個步(bu)驟(zhou)壹般(ban)用不到(dao)那種(zhong)精(jing)密的(de)實(shi)驗(yan)室儀器，我們(men)把小(xiao)室放在(zai)生物顯微(wei)鏡(jing)下，用(yong) 10× 物鏡（視(shi)野大，計數(shu)方便），拍上(shang)、下、左(zuo)、右(you)、中 5 個視(shi)野（每個視(shi)野間(jian)距盡(jin)量壹致(zhi)），別(bie)只(zhi)拍(pai)細胞(bao)多(duo)的(de)地(di)方(fang) —— 否(fou)則(ze)數(shu)據偏高(gao)，不客(ke)觀(guan)。

• 拍(pai)照(zhao)時保(bao)持曝光(guang)壹致(zhi)：同壹個(ge)實(shi)驗(yan)的(de)所(suo)有樣(yang)本，曝光時間(jian)、焦(jiao)距都(dou)要壹樣(yang)，避(bi)免(mian)後續(xu)分(fen)析(xi)時因(yin)亮(liang)度不同(tong)導(dao)致(zhi)計數(shu)誤(wu)差(cha)。

2. 計(ji)數(shu)：手動(dong)計數(shu) + 軟(ruan)件分(fen)析(xi)，雙(shuang)重驗證

• 手動(dong)計數(shu)：用 ImageJ 軟(ruan)件打(da)開(kai)圖片，用 “Cell Counter" 插件(jian)，逐(zhu)個視(shi)野數(shu)細胞(bao)（紫(zi)色(se)的(de)細胞(bao)核(he)都(dou)算），5 個視(shi)野取(qu)平(ping)均值(zhi)

• 軟(ruan)件分(fen)析(xi)：如果(guo)樣(yang)本多(duo)，可(ke)以用(yong) ImageJ 的(de) “Threshold" 功能，設(she)置(zhi)合(he)適的(de)閾值(zhi)（把細胞(bao)和(he)背(bei)景(jing)分開(kai)），然後用(yong) “Analyze Particles" 自(zi)動(dong)計數(shu)，最後(hou)和手動(dong)計數(shu)對(dui)比，誤(wu)差(cha)在(zai) 10% 以內(nei)就(jiu)可(ke)以用(yong)。

⚠️ 註意：如果(guo)細胞(bao)重疊太(tai)多(duo)（比如孵育時間(jian)太(tai)長(chang)），自(zi)動(dong)計數(shu)會(hui)不準(zhun)，必(bi)須(xu)手動(dong)計數(shu)，或者在(zai)染(ran)色(se)前(qian)用胰(yi)酶(mei)把下室的(de)細胞(bao)消(xiao)化(hua)下來，用(yong)流式(shi)細胞(bao)儀(yi)計(ji)數(shu)（更(geng)準(zhun)確(que)，但步驟(zhou)多(duo)）。

3. 重復(fu)實(shi)驗(yan)：至(zhi)少 3 次(ci)獨(du)立(li)重復(fu)，別(bie)偷懶(lan)

• 單個樣(yang)本(ben)做(zuo) 3 個復(fu)孔(kong)（比如對(dui)照(zhao)組(zu) 3 孔(kong)，處(chu)理組(zu) 3 孔(kong)），然後至(zhi)少做(zuo) 3 次(ci)獨(du)立(li)實(shi)驗(yan)（不同(tong)天(tian)做），最後(hou)用 “平均值(zhi) ± 標準(zhun)差(cha)（SD）" 表(biao)示(shi)數(shu)據，用 t 檢(jian)驗或 ANOVA 做統(tong)計分(fen)析(xi) —— 這(zhe)樣數(shu)據才有統計學意義，審稿(gao)人(ren)才(cai)會(hui)認可(ke)。

五、常(chang)見問(wen)題排查(zha)：做不出(chu)數(shu)據？先(xian)看(kan)這(zhe) 5 點

最後(hou)總結幾個(ge)客(ke)戶常(chang)問(wen)的(de)問(wen)題，幫大家(jia)快(kuai)速(su)定(ding)位(wei)問(wen)題所(suo)在(zai)：

     其實(shi) Transwell 遷移實(shi)驗(yan)，只(zhi)要把 “膜(mo)的(de)預處(chu)理、血清(qing)濃度差(cha)、細胞(bao)狀態、計(ji)數(shu)方法" 這(zhe)幾個(ge)關(guan)鍵(jian)點把控(kong)好，就(jiu)能穩(wen)出(chu)數(shu)據。如果(guo)還(hai)有其(qi)他問(wen)題，比如不知道選(xuan)哪種(zhong)孔(kong)徑的(de)小(xiao)室，或者需(xu)要匹(pi)配(pei)特定細胞(bao)的(de)實(shi)驗(yan)耗(hao)材，也可(ke)以進入蘇(su)州阿(e)爾法(fa)生物咨(zi)詢我 —— 畢(bi)竟我們(men)每天(tian)和這(zhe)些(xie)實(shi)驗(yan)耗(hao)材打(da)交道，對(dui)不同(tong)細胞(bao)的(de)適配(pei)性還(hai)是(shi)很熟的(de)。

最後(hou)提醒壹句(ju)：實(shi)驗(yan)過(guo)程(cheng)中做好記錄（比如細胞(bao)濃(nong)度、孵育時間(jian)、染(ran)色(se)時間(jian)），下次(ci)再(zai)做(zuo)就(jiu)能直接復(fu)用(yong)參(can)數(shu)，不用(yong)再(zai)從(cong)頭摸索(suo)啦(la)～