體外(wai)擴(kuo)增(zeng)已分選(xuan)的 T 細胞，需(xu)在(zai)保證細胞數(shu)量充足(zu)的同時，維(wei)持(chi)其(qi)良好(hao)的活(huo)性(xing)與功能，過(guo)程中(zhong)諸(zhu)多(duo)細節(jie)需精準(zhun)把(ba)控。
壹(yi)、體外(wai)擴(kuo)增(zeng) T 細胞的關鍵註意要(yao)點
起(qi)始(shi)細胞的質(zhi)量把(ba)控
分選(xuan)後的 T 細胞純度(du)需(xu)達(da)到(dao) 90% 以(yi)上，防止(zhi)其(qi)他細胞（如 B 細胞、NK 細胞）混(hun)入(ru)，避(bi)免因(yin)爭(zheng)奪(duo)營(ying)養而(er)幹(gan)擾(rao)擴(kuo)增(zeng)。同時要(yao)關註細胞活(huo)力(li)，當(dang)活(huo)細胞比例(li)低於 80% 時，擴(kuo)增(zeng)效率會(hui)顯著下降，可(ke)通過(guo)臺盼(pan)藍染色(se)或(huo)流(liu)式(shi)細胞術(shu)進(jin)行檢(jian)測。
細胞因(yin)子的合理(li)使(shi)用(yong)
T 細胞的活(huo)化(hua)和增(zeng)殖離不(bu)開細胞因(yin)子，IL-2 是(shi)常(chang)用的壹(yi)種，但(dan)過(guo)量使(shi)用(yong)會(hui)導(dao)致(zhi)細胞耗(hao)竭或(huo)分化(hua)為調節(jie)性 T 細胞（Treg），進(jin)而(er)影響(xiang)擴(kuo)增(zeng)效果。目(mu)前(qian)常(chang)聯合使(shi)用(yong) IL-7、IL-15 等(deng)，既(ji)能促(cu)進(jin)增(zeng)殖，又(you)能(neng)維(wei)持(chi)細胞特(te)性(xing)。需(xu)根(gen)據(ju)細胞狀(zhuang)態(tai)調整(zheng)濃度(du)，例(li)如初始階段(duan) IL-2 濃度(du)可(ke)設(she)為 500-1000 U/mL，後期(qi)逐(zhu)步降(jiang)低。
培(pei)養體系(xi)的無菌與營養平(ping)衡(heng)
全(quan)程(cheng)需(xu)嚴格(ge)執(zhi)行無菌操作，定(ding)期(qi)檢(jian)測培養基 pH 值(zhi)（維持(chi)在(zai) 7.2-7.4）和葡(pu)萄(tao)糖(tang)濃度(du)，當(dang)葡(pu)萄(tao)糖(tang)低於 2 g/L 時需(xu)及(ji)時換(huan)液(ye)。血(xue)清(qing)是(shi)傳(chuan)統培(pei)養中的關鍵成(cheng)分，但(dan)其(qi)批次差異較大(da)，可(ke)能引(yin)入外源因(yin)子，目(mu)前(qian)無血(xue)清(qing)培(pei)養基（如 X-VIVO 系列）因(yin)穩定(ding)性(xing)更優而(er)逐(zhu)漸(jian)普(pu)及(ji)。
細胞密(mi)度(du)與傳(chuan)代(dai)時機(ji)
細胞密(mi)度(du)過(guo)高會(hui)引(yin)發(fa)接觸(chu)抑(yi)制，過(guo)低則會(hui)導(dao)致(zhi)增(zeng)殖緩(huan)慢(man)，通常(chang)需(xu)維(wei)持(chi)在(zai) 1×10⁶-2×10⁶ cells/mL。當(dang)細胞密(mi)度(du)超過(guo) 3×10⁶ cells/mL 時，需(xu)按(an) 1:2 或(huo) 1:3 的比例(li)進(jin)行傳(chuan)代(dai)，傳(chuan)代(dai)時動(dong)作要(yao)輕(qing)柔(rou)，避(bi)免劇烈(lie)吹打造成(cheng)細胞損(sun)傷(shang)。
避(bi)免細胞功(gong)能(neng)退(tui)化(hua)
長(chang)期(qi)擴(kuo)增(zeng)可能導(dao)致(zhi) T 細胞表(biao)面(mian)活(huo)化(hua)受體（如 CD28）表(biao)達(da)下降，或(huo)產生(sheng) PD-1 等抑制(zhi)性分子，影響(xiang)細胞功(gong)能(neng)。可(ke)通(tong)過(guo)檢測細胞表(biao)面(mian)標誌(zhi)物(wu)（如 CD3⁺CD4⁺/CD8⁺比例(li)、PD-1 表(biao)達(da)量）監控細胞狀(zhuang)態(tai)，必要(yao)時加(jia)入 PD-1 抑(yi)制劑阻(zu)斷相關信(xin)號。
培(pei)養環(huan)境(jing)的穩定(ding)
培(pei)養箱需(xu)維持(chi) 37℃、5% CO₂、95% 濕(shi)度(du)的環(huan)境(jing)，溫度(du)波(bo)動(dong)若(ruo)超過(guo) ±0.5℃會影響(xiang)細胞代(dai)謝，CO₂濃度(du)異(yi)常(chang)則(ze)會(hui)直接改變(bian)培養基 pH 值(zhi)。此(ci)外(wai)，應避(bi)免頻繁(fan)開關培(pei)養箱，以(yi)減少對培(pei)養環(huan)境(jing)的幹擾(rao)。
二(er)、體外(wai)快(kuai)速(su)擴(kuo)增(zeng) T 細胞的常用(yong)方法
抗(kang) CD3/CD28 抗(kang)體激(ji)活(huo)法(fa)
這(zhe)是(shi)壹(yi)種經典(dian)方(fang)法：將抗(kang) CD3 抗(kang)體（模(mo)擬 TCR 信(xin)號）和抗(kang) CD28 抗(kang)體（提(ti)供(gong)共刺(ci)激信(xin)號）包(bao)被(bei)在(zai)培(pei)養瓶或(huo)磁(ci)珠上(shang)，與 T 細胞結(jie)合(he)後(hou)啟動活(huo)化(hua)通路(lu)，通常(chang)在 24-48 小(xiao)時內即可(ke)觀(guan)察到(dao)細胞體積(ji)增(zeng)大並開始增(zeng)殖，7-10 天可實現 10 倍(bei)以(yi)上(shang)的擴(kuo)增(zeng)。其中，磁(ci)珠法(fa)（如 Dynabeads）因(yin)細胞與抗(kang)體接(jie)觸(chu)更充分，效(xiao)率比直(zhi)接(jie)包(bao)被(bei)法(fa)高(gao) 2-3 倍(bei)。
采(cai)用經照(zhao)射滅(mie)活(huo)的同種異體細胞（如外周血(xue)單(dan)個(ge)核(he)細胞 PBMC）作(zuo)為飼(si)養層細胞，這(zhe)類(lei)細胞可(ke)分泌多(duo)種細胞因(yin)子並提(ti)供(gong)共刺(ci)激信(xin)號，能(neng)顯著提(ti)高(gao)擴(kuo)增(zeng)倍(bei)數(shu)。例(li)如，每 1×10⁶個(ge) T 細胞搭(da)配 1×10⁷個(ge) feeder 細胞，在(zai) 14 天左右(you)可實(shi)現 50-100 倍(bei)的擴(kuo)增(zeng)，但(dan)需(xu)註意 feeder 細胞的來源(yuan)和滅(mie)活(huo)效(xiao)果，以(yi)避(bi)免殘留活(huo)性(xing)細胞造(zao)成(cheng)影響(xiang)。
生(sheng)物(wu)反應器與自動化(hua)培養系統
傳(chuan)統培(pei)養瓶的擴(kuo)增(zeng)規(gui)模(mo)有(you)限，生(sheng)物(wu)反應器（如攪拌式(shi)、波浪(lang)式(shi)）通過(guo)動態(tai)培養提高(gao)氧(yang)氣和營(ying)養交換(huan)效(xiao)率，適(shi)合大(da)規(gui)模(mo)擴(kuo)增(zeng)，10L 的反應器可實現 10⁹級(ji)別(bie)細胞產量。自動(dong)化(hua)系統（如 CliniMACS Prodigy）能整合分選(xuan)、激活(huo)、擴(kuo)增(zeng)流程，減(jian)少人工(gong)操作誤差，同時通(tong)過(guo)實時監(jian)測調整(zheng)參數(shu)，比傳(chuan)統方(fang)法(fa)提(ti)速 30% 以(yi)上(shang)。
基(ji)因(yin)修飾(shi)增(zeng)強增(zeng)殖能力(li)
對(dui) T 細胞進(jin)行基(ji)因(yin)編輯(ji)（如敲(qiao)除 SOCS1 基(ji)因(yin)，解除細胞因(yin)子信(xin)號抑(yi)制(zhi)），或(huo)轉(zhuan)入(ru)永(yong)生(sheng)化(hua)基因(yin)（如端(duan)粒(li)酶(mei)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei) hTERT），可延長(chang)細胞增(zeng)殖周期(qi)。但(dan)這(zhe)種方法涉及(ji)基(ji)因(yin)改造(zao)，其(qi)應用需(xu)嚴格(ge)評估(gu)安全性(xing)。
研(yan)究發(fa)現，5% 的氧(yang)濃度(du)（接(jie)近(jin)體內淋巴(ba)結(jie)微(wei)環(huan)境(jing)）比常(chang)氧(yang)（21%）更能促(cu)進(jin) T 細胞增(zeng)殖，且能(neng)減(jian)少活(huo)性(xing)氧(yang)（ROS）積(ji)累(lei)導(dao)致(zhi)的細胞損(sun)傷(shang)，使(shi)擴(kuo)增(zeng)效率提(ti)升(sheng) 20%-50%，同時還(hai)能保留細胞更強的相關特(te)性(xing)。
三(san)、總結(jie)
體外(wai)擴(kuo)增(zeng) T 細胞的核心(xin)在於平(ping)衡(heng) “數量" 和 “質(zhi)量"—— 既要(yao)快(kuai)速(su)獲(huo)得(de)足夠數(shu)量的細胞，又(you)要(yao)確(que)保細胞具(ju)備良好(hao)的活(huo)性(xing)和功(gong)能。在(zai)實際操作中(zhong)，需(xu)根據(ju)具(ju)體需(xu)求(qiu)（如自體與異體 T 細胞的差異等(deng)）選(xuan)擇(ze)合(he)適(shi)的方法(fa)，同時通(tong)過(guo)嚴格(ge)的質(zhi)控體系(xi)監(jian)控每壹(yi)步(bu)驟，為後續(xu)的相關研(yan)究或(huo)應用奠(dian)定(ding)基(ji)礎(chu)。
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更新時間(jian)：2025-08-21
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