熒(ying)光(guang)定量PCR儀(yi)在(zai)檢(jian)測低濃(nong)度(du)樣本時(shi)，如(ru)何提高檢(jian)測靈(ling)敏(min)度？

熒(ying)光(guang)定量 PCR（qPCR）檢(jian)測低濃(nong)度(du)樣本時(shi)，靈(ling)敏(min)度受限於(yu)模板量少(shao)、擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率低、背(bei)景信號幹擾等問(wen)題。通(tong)過(guo)優(you)化(hua)樣本處理(li)、反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)、擴(kuo)增(zeng)策(ce)略及(ji)儀(yi)器(qi)參數(shu)，可提升(sheng)檢(jian)測靈(ling)敏(min)度。

以下從(cong)6 個(ge)核心(xin)維度詳(xiang)細說明具體(ti)方法：

壹(yi)、樣本制備(bei)：減少(shao)模板損失與抑制物(wu)幹擾

低濃(nong)度(du)樣本（如(ru)痕量(liang)核酸(suan)）的模(mo)板提取效率和(he)純度(du)是(shi)提升(sheng)靈(ling)敏(min)度的基(ji)礎，需重(zhong)點優(you)化(hua)：

• 高(gao)效(xiao)提取純化(hua)：選(xuan)擇針對低濃(nong)度(du)樣本的提取試劑(ji)盒(he)（如(ru)磁(ci)珠(zhu)法、柱提法），其通(tong)過(guo)特異(yi)性吸(xi)附核酸(suan)、減少(shao)洗脫(tuo)體(ti)積(ji)（如(ru)從 50μL 降(jiang)至(zhi) 20μL），可(ke)將核酸(suan)回(hui)收(shou)率(lv)提升(sheng) 30% 以上(shang)；避(bi)免使(shi)用酚 - 氯(lv)仿法（易殘(can)留(liu)抑制劑）。

• 去除抑制物(wu)：樣本中(zhong)若含(han)多糖、蛋白、腐殖(zhi)酸(suan)等抑制劑（常(chang)見(jian)於(yu)土(tu)壤(rang)、血(xue)液、糞便樣本），會顯著(zhu)抑制 Taq 酶活(huo)性。可通(tong)過(guo)以下方(fang)法去除：

◦ 提取後加入BSA（1-2 μg/μL） 或甘(gan)油（5%-10%），競(jing)爭性結合抑制劑；

◦ 采(cai)用核酸(suan)純化(hua)柱(zhu)二次純化(hua)，或(huo)用 DNase/RNase-free 水(shui)稀(xi)釋樣本（降低抑制劑濃(nong)度(du)）。

• 模(mo)板濃(nong)縮(suo)：對體積(ji)較(jiao)大(da)的(de)低濃(nong)度(du)樣本（如(ru)腦脊(ji)液、尿液），可通(tong)過(guo)乙醇(chun)沈(chen)澱(dian)（加糖原作為載體(ti)）或(huo)真(zhen)空(kong)濃(nong)縮(suo)儀(yi)濃(nong)縮(suo)，將模(mo)板濃(nong)度(du)提升(sheng) 5-10 倍（註(zhu)意避(bi)免過度(du)濃(nong)縮(suo)導致抑制劑富集）。

二、反應(ying)體(ti)系(xi)優(you)化(hua)：提升(sheng)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率與(yu)信號特(te)異(yi)性

低濃(nong)度(du)模(mo)板擴(kuo)增(zeng)時(shi)，需(xu)通(tong)過(guo)優(you)化(hua)體(ti)系(xi)組分(fen)減少(shao)非特(te)異(yi)性反應(ying)，增(zeng)強(qiang)目(mu)標信號：

• 引(yin)物(wu)與探(tan)針設(she)計：

◦ 引(yin)物(wu)：長(chang)度 18-25 bp，GC 含(han)量(liang) 40%-60%，避(bi)免二級結(jie)構（ΔG > -6 kcal/mol）和(he)引(yin)物(wu)二聚(ju)體（可(ke)通(tong)過(guo) Primer-BLAST 或 Oligo 軟(ruan)件驗(yan)證(zheng)）；擴(kuo)增(zeng)片段(duan)長(chang)度控制在(zai)80-150 bp（短(duan)片段(duan)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率更高，尤其適(shi)合低模(mo)板量）。

◦ 探針：優(you)先選擇TaqMan 探針（比 SYBR Green 特(te)異(yi)性更高，背(bei)景信號低），熒(ying)光(guang)基(ji)團(tuan)選(xuan)用量(liang)子(zi)點或(huo) Alexa Fluor 等(deng)強(qiang)熒(ying)光(guang)分(fen)子，淬(cui)滅基(ji)團(tuan)用 BHQ（淬(cui)滅效率(lv)高(gao)於(yu) TAMRA）；探針(zhen)濃(nong)度(du)優(you)化(hua)至(zhi) 0.2-0.4 μM（過(guo)高(gao)易(yi)形(xing)成(cheng)探針二聚(ju)體）。

• 酶與 dNTP 優(you)化(hua)：

◦ 選(xuan)擇高保真、高擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率的(de)熱(re)啟(qi)動酶（如(ru) Taq 酶的突(tu)變(bian)體，如(ru) Platinum Taq），其在(zai)高(gao)溫(wen)下激活(huo)，可減少(shao)低溫(wen)時(shi)的(de)非(fei)特(te)異(yi)性擴(kuo)增(zeng)；酶濃(nong)度(du)可(ke)適(shi)當(dang)提高（常(chang)規(gui) 1.25 U / 反應(ying)→1.5-2 U / 反(fan)應(ying)）。

◦ dNTP 濃(nong)度(du)調(tiao)整(zheng)為0.2-0.3 mM（過高(gao)會(hui)抑制酶活(huo)性，過低則限制擴(kuo)增(zeng)），並(bing)添加 dUTP（結合 UNG 酶可減少(shao) PCR 產物(wu)汙染）。

• 反(fan)應(ying)體(ti)積(ji)縮(suo)減：將(jiang)常(chang)規(gui) 20 μL 反應(ying)體(ti)系(xi)縮(suo)減至(zhi) 10 μL 或(huo) 5 μL，模板相對濃(nong)度(du)提升(sheng) 2-4 倍，同(tong)時(shi)減少(shao)試劑(ji)背(bei)景幹擾（需使(shi)用低吸(xi)附 PCR 管，避(bi)免模板吸(xi)附損(sun)失(shi)）。

三(san)、擴(kuo)增(zeng)策(ce)略：增(zeng)強(qiang)低模(mo)板擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率

針(zhen)對低濃(nong)度(du)模(mo)板的 “擴(kuo)增(zeng)瓶(ping)頸(jing)"，可采(cai)用特(te)異(yi)性更強(qiang)的(de)擴(kuo)增(zeng)策(ce)略：

• 巢(chao)式 / 半(ban)巢(chao)式(shi) qPCR：

◦ 第(di)壹(yi)輪(lun)用外(wai)側引(yin)物(wu)擴(kuo)增(zeng)（20-25 循(xun)環），產物(wu)作為第(di)二輪 qPCR 的(de)模(mo)板（用內側引(yin)物(wu)），通(tong)過(guo)兩(liang)輪(lun)擴(kuo)增(zeng)富集目(mu)標片段(duan)，靈(ling)敏(min)度可提升(sheng) 10-100 倍（需註(zhu)意避(bi)免交叉汙染）。

• 數(shu)字 PCR（dPCR）耦(ou)合(he)：

若實驗(yan)室(shi)有數(shu)字 PCR 儀(yi)，可(ke)將(jiang)低濃(nong)度(du)樣本通(tong)過(guo) dPCR 進行絕對定量(liang)。dPCR 通(tong)過(guo)將樣本分(fen)散至數(shu)萬微(wei)孔(kong)，實現單分(fen)子擴(kuo)增(zeng)，避(bi)免傳(chuan)統 qPCR 的 “指(zhi)數(shu)擴(kuo)增(zeng)偏差(cha)"，對 fg 級模(mo)板的檢(jian)測靈(ling)敏(min)度比 qPCR 高 1-2 個(ge)數(shu)量級(ji)（尤其適(shi)合拷貝(bei)數(shu)變異(yi)檢(jian)測）。

四、儀(yi)器(qi)參數(shu)：增(zeng)強(qiang)信號檢(jian)測靈(ling)敏(min)度

qPCR 儀(yi)的(de)光(guang)學系(xi)統和(he)溫控精(jing)度直(zhi)接影響微(wei)弱(ruo)信號的(de)捕(bu)捉(zhuo)，需針對性調(tiao)整(zheng)：

• 光學模(mo)塊優(you)化(hua)：

◦ 選(xuan)擇具有高靈(ling)敏(min)度 PMT（光電(dian)倍增(zeng)管） 或CCD 成(cheng)像(xiang)系統(tong)的儀(yi)器(qi)（如(ru)天(tian)能(neng)Tanon 化(hua)學發(fa)光成(cheng)像(xiang)系統(tong)），其可檢(jian)測低至(zhi) 0.1 熒(ying)光(guang)單位(wei)的信號變(bian)化(hua)。

◦ 調(tiao)整(zheng)熒(ying)光(guang)檢(jian)測增(zeng)益值（Gain）：在(zai)儀(yi)器(qi)軟件(jian)中(zhong)提高目標熒(ying)光(guang)通(tong)道(dao)的增(zeng)益（如(ru) FAM 通(tong)道(dao)），增(zeng)強(qiang)信號強(qiang)度(du)（需同(tong)時(shi)檢(jian)測空(kong)白對照，避(bi)免增(zeng)益過高導致背(bei)景噪音增(zeng)加）。

• 循環參數(shu)調(tiao)整(zheng)：

◦ 延(yan)長(chang)退(tui)火(huo) / 延(yan)伸(shen)時(shi)間(jian)：低濃(nong)度(du)模(mo)板結合引(yin)物(wu)的概(gai)率低，可(ke)將(jiang)退(tui)火(huo)時(shi)間(jian)從(cong) 30 秒延(yan)長(chang)至 45-60 秒(miao)，延(yan)伸(shen)時(shi)間(jian)從(cong) 30 秒延(yan)長(chang)至 60 秒(miao)（適(shi)用於(yu)長(chang)片段(duan)，但(dan)需避(bi)免酶活(huo)性衰減）。

◦ 增(zeng)加循環數(shu)：常(chang)規(gui) qPCR 循環數(shu)為 40，低濃(nong)度(du)樣本可增(zeng)加至 45-50 循環（需設(she)置(zhi)陰性對照，排(pai)除非特異(yi)性擴(kuo)增(zeng)累(lei)積）。

五、減少(shao)汙染與(yu)背(bei)景信號

低濃(nong)度(du)樣本擴(kuo)增(zeng)時(shi)，微(wei)量(liang)汙染（如(ru)氣溶(rong)膠(jiao)、交叉汙染）或(huo)非(fei)特(te)異(yi)性擴(kuo)增(zeng)的(de)影響被(bei)放(fang)大，需(xu)嚴(yan)格控制：

• 實驗(yan)環境(jing)分(fen)區：將(jiang)樣本制備(bei)區、反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)配(pei)置(zhi)區、擴(kuo)增(zeng)區分(fen)離(li)，使(shi)用獨(du)立(li)移液器(qi)和(he)耗(hao)材（如(ru)帶濾(lv)芯(xin)吸(xi)頭）。

• 抑制非特異(yi)性擴(kuo)增(zeng)：

◦ 反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)中(zhong)加入UDG 酶（尿嘧(mi)啶 - DNA 糖基(ji)化(hua)酶） 和(he) dUTP，擴(kuo)增(zeng)前 37℃處理(li) 10 分(fen)鐘，降解含(han) dUTP 的(de)汙染產物(wu)。

◦ 優(you)化(hua)退(tui)火(huo)溫(wen)度：通(tong)過(guo)梯度(du) PCR 確定(ding)最(zui)高特異(yi)性退(tui)火(huo)溫(wen)度（通(tong)常(chang)比(bi) Tm 低 3-5℃），減少(shao)引(yin)物(wu)二聚(ju)體和(he)非特(te)異(yi)性條(tiao)帶。

六(liu)、數(shu)據處(chu)理(li)：降(jiang)低隨(sui)機(ji)誤差(cha)

低濃(nong)度(du)樣本的擴(kuo)增(zeng)曲(qu)線波(bo)動較(jiao)大(da)，需(xu)通(tong)過(guo)數(shu)據處(chu)理(li)提高可靠性：

• 增(zeng)加技術(shu)重(zhong)復(fu)：每(mei)個(ge)樣本設置(zhi) 3-5 次技術(shu)重(zhong)復(fu)，通(tong)過(guo)平均值減少(shao)隨(sui)機(ji)誤差(cha)（避(bi)免單壹(yi)重(zhong)復(fu)的(de)假(jia)陰(yin)性）。

• 優(you)化(hua)閾(yu)值（Ct 值）設(she)定(ding)：手(shou)動調(tiao)整(zheng)閾值至(zhi)擴(kuo)增(zeng)曲(qu)線的(de)指(zhi)數(shu)期早(zao)期(qi)（避(bi)免進入平臺(tai)期），確保低濃(nong)度(du)樣本的 Ct 值被(bei)準(zhun)確捕(bu)捉(zhuo)（而非被背(bei)景信號掩(yan)蓋）。

總結(jie)

提升(sheng)低濃(nong)度(du)樣本 qPCR 靈(ling)敏(min)度的核心(xin)邏(luo)輯是(shi)：模(mo)板保留→增(zeng)強(qiang)擴(kuo)增(zeng)特(te)異(yi)性→優(you)化(hua)信號檢(jian)測→控制背(bei)景幹擾。實際操作(zuo)中(zhong)，可優(you)先從樣本提取（如(ru)磁(ci)珠(zhu)法 + 濃(nong)縮(suo)）和(he)反應(ying)體(ti)系(xi)（如(ru)熱(re)啟(qi)動酶 + 巢式(shi) PCR）入手(shou)，結合(he)儀(yi)器(qi)參數(shu)調(tiao)整(zheng)，通(tong)常(chang)可(ke)將(jiang)檢(jian)測下限從(cong) ng 級提升(sheng)至 pg 甚(shen)至 fg 級(ji)，滿(man)足(zu)痕(hen)量(liang)核酸(suan)檢(jian)測需求(qiu)（如(ru)病(bing)毒早(zao)期(qi)感染、微(wei)量(liang)腫瘤(liu) DNA 檢(jian)測等場景）。