熒(ying)光(guang)定量(liang) PCR 中無(wu) Ct 值或 Ct值過(guo)晚,該(gai)如何(he)解(jie)決(jue)？

在(zai)熒(ying)光(guang)定量(liang) PCR 實驗(yan)裏(li)，無(wu) Ct 值出現和(he) Ct 值過(guo)晚是常(chang)讓(rang)科研人員(yuan)頭(tou)疼的問(wen)題。這些問(wen)題會嚴重(zhong)幹(gan)擾實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)的準(zhun)確性(xing)與可靠(kao)性，接(jie)下(xia)來(lai)我們(men)就(jiu)深(shen)入(ru)探討下背後的原因和(he)解決(jue)辦法。

壹、無(wu) Ct 值出現的原因及(ji)解(jie)決(jue)辦法

（壹）循環數(shu)設置(zhi)不(bu)合理  正(zheng)常(chang)情況(kuang)下(xia)，PCR 循環數(shu)壹般不(bu)宜超(chao)過 45 循環。要(yao)是循(xun)環數(shu)設置(zhi)不(bu)夠，可能(neng)因(yin)擴(kuo)增(zeng)產物量(liang)不夠(gou)，熒(ying)光(guang)信(xin)號沒(mei)達到可檢(jian)測水(shui)平(ping)，導(dao)致無(wu) Ct 值。比如在(zai)壹些低(di)拷(kao)貝數模板(ban)的(de)檢(jian)測中，若循環數(shu)只(zhi)設 30 次，很(hen)可(ke)能(neng)就(jiu)檢(jian)測不(bu)到產(chan)物。

解決(jue)辦法：依(yi)據實(shi)驗(yan)經(jing)驗(yan)和(he)模板(ban)預(yu)估(gu)量(liang)，合理增(zeng)加循(xun)環數(shu)，不(bu)過要(yao)註意(yi)，循環數(shu)過(guo)高(gao)也(ye)會使背景(jing)值提(ti)高(gao)，定(ding)量(liang)不準(zhun)，通(tong)常(chang)調整到(dao) 35 - 40 循環較(jiao)為(wei)合適(shi)。

（二）PCR 程(cheng)序裏(li)檢(jian)測熒(ying)光(guang)信(xin)號步(bu)驟有誤  不同熒(ying)光(guang)定量(liang)方(fang)法(fa)，采(cai)集熒(ying)光(guang)信(xin)號的時機有別。像(xiang) SG 法壹般在(zai) 72℃延(yan)伸(shen)時(shi)采集，TaqMan 法則(ze)多在(zai)退(tui)火(huo)結束(shu)或延(yan)伸(shen)時(shi)采集。要(yao)是 PCR 程(cheng)序(xu)設置(zhi)時(shi)，熒(ying)光(guang)采集步(bu)驟和(he)所用方(fang)法(fa)不(bu)匹配，或(huo)者壓(ya)根(gen)沒(mei)勾選(xuan)熒(ying)光(guang)采集選項，那肯定(ding)檢(jian)測不(bu)到熒(ying)光(guang)信(xin)號，也(ye)就(jiu)沒(mei)有 Ct 值。

解決(jue)辦法：仔(zai)細核對所用熒(ying)光(guang)定量(liang)方(fang)法(fa)的(de)說(shuo)明(ming)書，嚴格按(an)要(yao)求(qiu)設置(zhi) PCR 程(cheng)序裏(li)熒(ying)光(guang)信(xin)號檢(jian)測步(bu)驟，確保(bao)準(zhun)確采(cai)集熒(ying)光(guang)信(xin)號。

（三(san)）引物或探針(zhen)降解  引物或探針(zhen)降解後(hou)，無(wu)法正(zheng)常(chang)和(he)模板(ban)結(jie)合並引導(dao)擴(kuo)增(zeng)，自(zi)然不(bu)會有擴(kuo)增(zeng)產物，也(ye)就(jiu)無(wu) Ct 值。可通(tong)過(guo) PAGE 電(dian)泳(yong)檢(jian)測引物和(he)探針(zhen)是否降(jiang)解，降(jiang)解的(de)引物或探針(zhen)在(zai)電泳圖(tu)上(shang)會呈(cheng)現出條(tiao)帶(dai)模(mo)糊(hu)、拖(tuo)尾等(deng)異(yi)常(chang)。

解(jie)決(jue)辦法：重(zhong)新(xin)合成高(gao)質(zhi)量(liang)引物和(he)探針(zhen)，註意(yi)引物和(he)探針(zhen)的保存條(tiao)件，避(bi)免反復(fu)凍(dong)融，最(zui)好小量(liang)分裝，存放在(zai) - 20℃或 - 80℃。

（四(si)）模板(ban)降(jiang)解(jie)或上(shang)樣(yang)量(liang)不夠(gou)  模(mo)板(ban)降(jiang)解(jie)，完(wan)整(zheng)性被破壞，擴(kuo)增(zeng)難以(yi)進(jin)行；上(shang)樣(yang)量(liang)不夠(gou)，起(qi)始(shi)模(mo)板(ban)拷(kao)貝數少，擴(kuo)增(zeng)產物量(liang)也(ye)會很(hen)少(shao)，導(dao)致熒(ying)光(guang)信(xin)號弱(ruo)，檢(jian)測不(bu)到 Ct 值(zhi)。壹般模(mo)板(ban)上(shang)樣(yang)量(liang)不超(chao) 500ng，對未知(zhi)濃度(du)樣(yang)本(ben)，應從(cong)系(xi)列(lie)稀(xi)釋樣(yang)本(ben)的(de)最(zui)高(gao)濃度(du)開始(shi)實驗(yan)。另(ling)外(wai)，樣(yang)本(ben)準(zhun)備過程(cheng)中引入(ru)雜質(zhi)、反復(fu)凍(dong)融，都(dou)可能(neng)造成模(mo)板(ban)降(jiang)解(jie)。

解決(jue)辦法：優化(hua)樣(yang)本(ben)提(ti)取(qu)和(he)保存方(fang)法(fa)，確保(bao)模(mo)板(ban)質(zhi)量(liang)。提取(qu)後(hou)盡(jin)快實驗(yan)，如需保存，將模板(ban)樣(yang)本(ben)小量(liang)分裝儲備，避(bi)免反復(fu)凍(dong)融。實(shi)驗(yan)前(qian)，用核酸(suan)定(ding)量(liang)儀精(jing)確測(ce)定(ding)模(mo)板(ban)濃度(du)，依據(ju)濃度(du)調整上(shang)樣(yang)量(liang)。

（五(wu)）引物探針(zhen)設計不(bu)合理  引物設計要(yao)是不(bu)合理，像(xiang)上(shang)下遊(you)引物 Tm 值差異超(chao) 4℃，會影(ying)響(xiang)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)，甚(shen)至導致擴(kuo)增(zeng)失敗，沒(mei)有 Ct 值；引物若不能跨(kua)越內含(han)子，擴(kuo)增(zeng)基因(yin)組 DNA 時(shi)，可能受內(nei)含(han)子幹(gan)擾，影(ying)響(xiang)結果(guo)。

解決(jue)辦法：借(jie)助(zhu)專業(ye)引物設計軟件，如 Primer Premier 5.0 等，精心(xin)設計引物。設計好(hao)後，進行 BLAST 比對，確保(bao)引物特(te)異性(xing)，避(bi)免與其他基因(yin)序(xu)列(lie)有過多同源(yuan)性。

二、Ct 值(zhi)過晚(wan)的(de)原因及(ji)解(jie)決(jue)辦法

（壹）擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)低(di)

1. 引物間(jian)或引物與探針(zhen)比例不(bu)當：引物和(he)探針(zhen)濃度(du)不合適(shi)，比(bi)如引物濃度(du)過高(gao)，可(ke)能(neng)形成引物二聚體，競爭模(mo)板(ban)結(jie)合位(wei)點，降(jiang)低(di)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)；引物和(he)探針(zhen)比例失衡(heng)，也(ye)會影(ying)響(xiang)擴(kuo)增(zeng)。

解決(jue)辦法：通(tong)過(guo)預(yu)實(shi)驗(yan)，優化(hua)引物和(he)探針(zhen)濃度(du)及(ji)比(bi)例(li)，摸(mo)索出最(zui)佳反應體系。

2. 引物或探針(zhen)設計不(bu)合理：引物長(chang)度(du)、GC 含(han)量(liang)、特(te)異性(xing)等(deng)不(bu)合適(shi)，都(dou)可能致使(shi)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)低(di)，Ct 值(zhi)過(guo)晚(wan)。比(bi)如引物長(chang)度(du)過長(chang)，退(tui)火(huo)時難以(yi)和(he)模板(ban)配對，影(ying)響(xiang)擴(kuo)增(zeng)。

解決(jue)辦法：重(zhong)新(xin)設計引物和(he)探針(zhen)，保證(zheng)引物長(chang)度(du)適(shi)中（壹般 18 - 25bp），GC 含(han)量(liang)在(zai) 40% - 60%，同時具備高(gao)特(te)異性(xing)。

（二）PCR 程(cheng)序不(bu)合適(shi)

1. 改用三(san)步(bu)法反應：兩(liang)步(bu)法反應中，退(tui)火(huo)和(he)延(yan)伸(shen)在(zai)同壹溫(wen)度(du)進行，可能對某些(xie)模板(ban)和(he)引物組合效(xiao)果(guo)欠佳。三(san)步(bu)法將(jiang)退(tui)火(huo)、延(yan)伸(shen)分(fen)開，能(neng)更好(hao)優化(hua)反應條(tiao)件。

解決(jue)辦法：嘗(chang)試(shi)將 PCR 程(cheng)序(xu)改為(wei)三(san)步(bu)法，即變性、退(tui)火(huo)、延(yan)伸(shen)分(fen)別在(zai)不同溫(wen)度(du)下進(jin)行，依據引物 Tm 值，合理設置(zhi)退(tui)火(huo)溫(wen)度(du)。

2. 優化(hua)退(tui)火(huo) / 延(yan)伸(shen)溫(wen)度(du)：退(tui)火(huo)溫(wen)度(du)過高(gao)，引物和(he)模板(ban)結(jie)合不充(chong)分(fen)；過低(di)，易(yi)產(chan)生非特(te)異性(xing)擴(kuo)增(zeng)。延(yan)伸(shen)溫(wen)度(du)不合適(shi)，會(hui)影(ying)響(xiang) Taq 酶活(huo)性(xing)和(he)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)。

解(jie)決(jue)辦法：以(yi)引物 Tm 值為參考(kao)，適(shi)當(dang)降低(di)退(tui)火(huo)溫(wen)度(du)（壹般降(jiang)低(di) 3 - 5℃），優化(hua)延(yan)伸(shen)溫(wen)度(du)（通(tong)常(chang) 72℃左(zuo)右(you)），通(tong)過(guo)預(yu)實(shi)驗(yan)確定(ding)最(zui)佳溫(wen)度(du)。

3. 延(yan)長(chang)退(tui)火(huo) / 延(yan)伸(shen)時(shi)間(jian)：退(tui)火(huo)或延(yan)伸(shen)時(shi)間(jian)過短，引物和(he)模板(ban)結(jie)合不充(chong)分(fen)，擴(kuo)增(zeng)產物合成，導(dao)致 Ct 值(zhi)過(guo)晚(wan)。

解(jie)決(jue)辦法：在(zai)推薦(jian)時(shi)間(jian)基礎(chu)上(shang)，適(shi)當(dang)延(yan)長(chang)退(tui)火(huo) / 延(yan)伸(shen)時(shi)間(jian) 10s 左右(you)，觀(guan)察擴(kuo)增(zeng)效(xiao)果(guo)。

（三(san)）MgCl₂濃度(du)不合適(shi)Mg²⁺是 Taq 酶(mei)活(huo)性(xing)必(bi)需離子，濃度(du)過高(gao)或(huo)過(guo)低(di)，都(dou)會(hui)影(ying)響(xiang) Taq 酶活(huo)性(xing)和(he)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)。濃度(du)過高(gao)，可(ke)能(neng)增(zeng)加非特(te)異性(xing)擴(kuo)增(zeng)；過低(di)，Taq 酶(mei)活(huo)性(xing)受抑(yi)制(zhi)。

解(jie)決(jue)辦法：依(yi)據所(suo)用 PCR 試(shi)劑盒推薦(jian)，適(shi)當(dang)調整 MgCl₂濃度(du)，通(tong)過(guo)預(yu)實(shi)驗(yan)確定(ding)最(zui)適(shi)濃度(du)。

（四(si)）PCR 產物過長(chang)  PCR 產(chan)物設計超(chao)過 500bp，擴(kuo)增(zeng)難度(du)會增(zeng)加，所(suo)需時(shi)間(jian)更長(chang)，導(dao)致 Ct 值(zhi)過(guo)晚(wan)。因(yin)為(wei)長(chang)片(pian)段(duan)擴(kuo)增(zeng)對反應條(tiao)件要(yao)求(qiu)更(geng)嚴苛，容(rong)易(yi)出現擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)低(di)的(de)問(wen)題。

解決(jue)辦法：重(zhong)新(xin)設計引物，縮短 PCR 產物長(chang)度(du)，壹般控(kong)制(zhi)在(zai) 100 - 300bp，更利於(yu)高(gao)效(xiao)擴(kuo)增(zeng)。

（五(wu)）模(mo)板(ban)中存在(zai)抑(yi)制(zhi)物     模板(ban)提(ti)取(qu)過程(cheng)中，若混(hun)入(ru)蛋白質、多糖、有機溶劑等雜(za)質(zhi)，這些(xie)物質可能抑(yi)制(zhi) Taq 酶(mei)活(huo)性(xing)，降低(di)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)，使(shi) Ct 值過晚(wan)。解(jie)決(jue)辦法：使(shi)用高(gao)純(chun)度(du)模板(ban)進(jin)行 PCR 檢(jian)測，或(huo)對模板(ban)進(jin)行稀釋，降低(di)抑(yi)制(zhi)物濃度(du)。也(ye)可采用模板(ban)純(chun)化試(shi)劑盒，進壹步(bu)去(qu)除(chu)雜(za)質(zhi)。      更(geng)多關於(yu)熒(ying)光(guang)定量(liang) PCR 儀原理、熒(ying)光(guang)定量(liang) PCR 儀品牌(pai)、熒(ying)光(guang)定量(liang) PCR 儀價(jia)格、實(shi)時熒(ying)光(guang)定量(liang) PCR 技術、熒(ying)光(guang)定量(liang) PCR 實驗(yan)步(bu)驟等(deng)實驗(yan)室(shi)儀(yi)器(qi)，實驗(yan)耗材(cai)，生物試(shi)劑相(xiang)關(guan)問(wen)題，歡(huan)迎(ying)進(jin)入(ru)蘇(su)州(zhou)阿(e)爾(er)法(fa)生物實驗(yan)器(qi)材(cai)有限公司(si)網站進(jin)行了解。