Millicell ERS-3.0 數字(zi)細(xi)胞電(dian)阻儀在(zai)藥(yao)物(wu)研(yan)發(fa)領(ling)域的(de)應(ying)用(yong)

Millicell ERS-3.0 數字(zi)細(xi)胞電(dian)阻儀在(zai)藥(yao)物(wu)研(yan)發(fa)領(ling)域有著(zhe)廣泛(fan)的(de)應(ying)用(yong)，以下為您(nin)介(jie)紹(shao)壹些(xie)成功(gong)案(an)例(li)：

壹、黃(huang)諾馬(ma)苷(gan)在(zai) MDCK 單層(ceng)細(xi)胞模(mo)型上(shang)的(de)轉運(yun)機(ji)制(zhi)分析(xi)

研(yan)究(jiu)目(mu)的(de)：研(yan)究(jiu)黃(huang)諾馬(ma)苷(gan)在(zai)馬(ma)丁達(da)比(bi)犬腎上(shang)皮（MDCK）單層(ceng)細(xi)胞模(mo)型上(shang)的(de)吸(xi)收轉運(yun)特性(xing)。

實驗(yan)方法：利(li)用(yong)噻唑(zuo)藍(lan)（MTT）比(bi)色法考(kao)察(cha)黃(huang)諾馬(ma)苷(gan)對(dui) MDCK 細(xi)胞的(de)毒性(xing)，使(shi)用(yong) Millicell-ERS-2 型細(xi)胞電(dian)阻儀檢測 MDCK 單層(ceng)細(xi)胞模(mo)型的(de)電(dian)阻值，考察(cha)黃(huang)諾馬(ma)苷(gan)的(de)質(zhi)量(liang)濃度、給藥(yao)時間以(yi)及(ji)鈉 - 葡萄(tao)糖協(xie)同(tong)轉運(yun)蛋白(bai)（SGLTs）抑(yi)制(zhi)劑和(he)葡萄(tao)糖轉運(yun)蛋白(bai) 2（GLUT2）抑(yi)制(zhi)劑對其跨(kua)膜(mo)轉運(yun)的(de)影(ying)響(xiang)，采用(yong) UPLC-MS/MS 測定黃(huang)諾馬(ma)苷(gan)的(de)含(han)量(liang)，計(ji)算表(biao)觀(guan)滲(shen)透系(xi)數（Papp）及(ji)外(wai)排(pai)比(bi)（ER）。

研究結(jie)果：黃(huang)諾馬(ma)苷(gan)質(zhi)量(liang)濃度為 5.625 - 120mg・L-1 時對 MDCK 細(xi)胞無明顯毒性(xing)作用(yong)，黃(huang)諾馬(ma)苷(gan)在(zai) MDCK 單層(ceng)細(xi)胞模(mo)型上(shang)的(de)轉運(yun)具(ju)有時間、濃度依賴(lai)性(xing)，且 Papp 基本(ben)處(chu)於(yu) 1×10-6 - 10×10-6cm・s-1。在(zai) 60min 和(he) 90min 時，與(yu)空(kong)白(bai)組相比(bi)，根皮苷(gan)組中(zhong)黃(huang)諾馬(ma)苷(gan)在(zai) MDCK 單層(ceng)細(xi)胞模(mo)型上(shang)的(de)轉運(yun)量(liang)減少(shao)。結(jie)論為黃(huang)諾馬(ma)苷(gan)在(zai)腸道中(zhong)屬於中(zhong)等(deng)吸收的(de)藥(yao)物(wu)，其(qi)跨(kua)膜(mo)轉運(yun)機(ji)制(zhi)以被動轉運(yun)為主(zhu)，兼(jian)有主(zhu)動(dong)轉運(yun)存(cun)在(zai)，且(qie) SGLTs 轉運(yun)體可(ke)能(neng)參與(yu)介導了(le)黃(huang)諾馬(ma)苷(gan)在(zai) MDCK 單層(ceng)細(xi)胞模(mo)型上(shang)的(de)轉運(yun)。

二、血腦 / 血瘤(liu)屏障(zhang)體外(wai)模(mo)型的(de)構(gou)建、形態(tai)與(yu)功能特性(xing)

研究(jiu)目的(de)：構(gou)建並(bing)觀測血(xue)腦 / 血瘤(liu)屏障(zhang)體外(wai)模(mo)型的(de)形態(tai)與(yu)功能特性(xing)，為中(zhong)樞神經系(xi)統(tong)藥(yao)物(wu)跨(kua)血(xue)腦和(he)（或(huo)）血瘤(liu)屏障(zhang)研究(jiu)提供(gong)體外(wai)實驗(yan)模(mo)型。

實驗(yan)方法：將(jiang)分離的(de) Balb/C 小(xiao)鼠(shu)腦微血管內(nei)皮細(xi)胞（BMEC）在(zai)鋪(pu)有明膠(jiao)的(de)微孔膜上(shang)單層(ceng)培養或(huo)與(yu)大鼠膠質瘤(liu)細(xi)胞 C6 雙室共(gong)培養，分別建立(li)血腦屏障(zhang)（BBB）和(he)血瘤(liu)屏障(zhang)（BTB）模(mo)型，采用(yong)光鏡和(he)掃(sao)描(miao)電(dian)鏡觀察(cha) BMEC 形態(tai)，采用(yong) Millicell-ERS 系(xi)統(tong)檢測屏(ping)障(zhang)中(zhong)的(de)跨(kua)內(nei)皮(pi)電(dian)阻（TEERs），免疫細(xi)胞化(hua)學檢測 P - 糖(tang)蛋白(bai)（P-gp）表(biao)達(da)，並(bing)比(bi)較(jiao) BBB 和(he) BTB 中(zhong) BMEC 的(de)形態(tai)和(he)功能特征。

研究(jiu)結(jie)果：兩(liang)組模(mo)型中(zhong)的(de) BMEC 均(jun)形成單層(ceng)生(sheng)長(chang)和(he)良好(hao)的(de)細(xi)胞間(jian)緊(jin)密(mi)連接，產生(sheng)較(jiao)高(gao)的(de) TEERs 值(zhi)，並(bing)檢測到 P-gp 表(biao)達(da)。瘤(liu)細(xi)胞誘(you)導使(shi) BMEC 間(jian)出(chu)現(xian)間隙(xi)，同(tong)時相點 TEERs 值降低，P-gp 表達(da)減弱。結(jie)論為兩種(zhong)體外(wai)模(mo)型可(ke)用(yong)於研(yan)究藥物(wu)跨(kua)血(xue)腦和(he)（或(huo)）血瘤(liu)屏障(zhang)特性(xing)，其中(zhong) BTB 模(mo)型可(ke)能(neng)更適合抗腫(zhong)瘤(liu)藥物(wu)的(de)研(yan)究(jiu)。

三(san)、腸道微生(sheng)物(wu)對(dui) Caco-2 腸上(shang)皮細(xi)胞單層(ceng)屏障(zhang)作用(yong)的(de)機(ji)制(zhi)研究

研究(jiu)目(mu)的(de)：利(li)用(yong) Caco-2 腸上(shang)皮細(xi)胞單層(ceng)屏障(zhang)模(mo)型研究(jiu)四(si)種腸道微生(sheng)物(wu)對(dui)腸道屏障(zhang)的(de)影(ying)響(xiang)。

實驗(yan)方法：建立(li) Caco-2 腸上(shang)皮細(xi)胞單層(ceng)屏障(zhang)模(mo)型，堿性(xing)磷酸(suan)酶(mei)檢測細(xi)胞極性(xing)。將實驗(yan)分為空(kong)白(bai)對(dui)照組、大腸埃希(xi)菌組、肺炎(yan)克(ke)雷伯菌組、糞腸球菌組、乳酸(suan)桿(gan)菌組，在各組細(xi)菌作(zuo)用(yong)下，Millicell-ERS 電(dian)阻測定儀測定 Caco-2 腸上(shang)皮細(xi)胞單層(ceng)跨(kua)上(shang)皮細(xi)胞電(dian)阻 TEER 值變化(hua)、酶標儀檢測熒(ying)光黃(huang)通(tong)過(guo)率(lv)的(de)變化(hua)；酶聯免(mian)疫吸(xi)附(fu)法（ELISA）檢測單層(ceng)細(xi)胞 zonulin；電(dian)鏡觀察(cha)細(xi)胞間(jian)緊(jin)密(mi)連接超微結(jie)構(gou)變化(hua)；免疫熒(ying)光、Western blot 方法檢測緊(jin)密(mi)連接（TJ）相關(guan)蛋白(bai) Occludin、Claudin-1、ZO-1 表(biao)達(da)、分布和(he)超微結(jie)構(gou)變化(hua)。

研究結(jie)果：堿性(xing)磷酸(suan)酶(mei)測定細(xi)胞單層(ceng)呈(cheng)極性(xing)，TEER 值穩定在(zai) 250 ㎝2，建模(mo)成功(gong)；腸道大腸埃希(xi)菌、肺炎(yan)克(ke)雷伯菌、糞(fen)腸球菌均(jun)引起(qi)細(xi)胞單層(ceng)屏障(zhang)通(tong)透性(xing)升(sheng)高(gao)，TEER 值明(ming)顯下降，熒光黃(huang)透過(guo)率(lv)增(zeng)高(gao)，與(yu)對照組相比(bi)較(jiao)差異(yi)顯著；大(da)腸埃希(xi)菌、肺炎(yan)克(ke)雷伯菌作(zuo)用(yong)後細(xi)胞釋(shi)放(fang) zonulin 蛋白(bai)增(zeng)加(jia)，與(yu)對照組相比(bi)有統(tong)計(ji)學差(cha)異(yi)，糞(fen)腸球菌作(zuo)用(yong)於 Caco-2 細(xi)胞單層(ceng)後，zonulin 釋(shi)放(fang)量(liang)較(jiao)對照組升(sheng)高(gao)，但差(cha)異(yi)無統(tong)計(ji)學意(yi)義，乳酸(suan)桿(gan)菌組 zonulin 釋(shi)放(fang)量(liang)與(yu)對照組無顯著差(cha)異；大腸埃希(xi)菌與(yu)單層(ceng)細(xi)胞作(zuo)用(yong) 6 小時後透射電(dian)子顯微鏡觀察(cha)單層(ceng)細(xi)胞屏(ping)障(zhang)可(ke)見(jian)細(xi)胞表(biao)面微絨毛變稀(xi)，絨(rong)毛有脫(tuo)落，細(xi)胞間(jian)緊(jin)密(mi)連接電(dian)子密(mi)度降低，斷(duan)裂，間(jian)隙(xi)增(zeng)寬；大腸埃希(xi)菌組、肺炎(yan)克(ke)雷伯菌組三種緊(jin)密(mi)連接蛋白(bai) Occludin、Claudin-1、ZO-1 表(biao)達(da)明顯減少(shao)。糞腸球菌組、乳酸(suan)菌組 Occludin、Claudin-1 表達(da)與(yu)空(kong)白(bai)對(dui)照組相比(bi)無明顯變化(hua)，胞漿蛋白(bai) ZO-1 表(biao)達(da)降低。細(xi)菌作(zuo)用(yong) 6 小時後免疫熒(ying)光觀察(cha)緊(jin)密(mi)連接蛋白(bai)分布情(qing)況(kuang)，大(da)腸埃希(xi)菌組和(he)肺炎(yan)克(ke)雷伯菌組可(ke)見(jian)熒光較(jiao)正(zheng)常(chang)組松散(san)，不連續(xu)，可(ke)見(jian)明顯鋸齒(chi)狀(zhuang)分布，甚至缺(que)口及(ji)裂隙(xi)樣表現(xian)，熒光強度減弱，糞(fen)腸球菌組、乳酸(suan)菌組熒光強度稍減弱，但(dan)仍沿胞膜(mo)分布，條帶(dai)較(jiao)清晰，與(yu)空(kong)白(bai)對(dui)照組差異不明顯。

四(si)、烏(wu)司他丁對(dui)腸道上(shang)皮細(xi)胞屏(ping)障(zhang)損傷(shang)的(de)保(bao)護(hu)作(zuo)用(yong)分析(xi)

研(yan)究(jiu)目(mu)的(de)：探討(tao)烏(wu)司他丁（UTI）對(dui)腸道上(shang)皮細(xi)胞屏(ping)障(zhang)損傷(shang)的(de)保(bao)護(hu)作(zuo)用(yong)及(ji)其機(ji)制(zhi)。

實驗(yan)方法：培養 Caco-2 細(xi)胞，並(bing)建立(li)腫瘤(liu)壞死因子(zi) α（TNF-α）誘(you)導的(de)單層(ceng)上(shang)皮細(xi)胞模(mo)型，隨機(ji)分為空(kong)白(bai)對(dui)照組、TNF-α 模(mo)型組、UTI 低劑量(liang)組（5 萬 U/kg）、UTI 中(zhong)劑(ji)量(liang)組（10 萬 U/kg）、UTI 高(gao)劑量(liang)組（20 萬 U/kg）。采用(yong) Millicell 電(dian)阻儀和(he)多功能(neng)讀板(ban)儀分別測定各組上(shang)皮細(xi)胞電(dian)阻（TER）和(he)異硫氰(qing)酸(suan)熒(ying)光素標記的(de)葡聚糖(tang)（FITC-dextran），酶(mei)聯免(mian)疫吸(xi)附(fu)測定法(fa)（ELISA）測定白(bai)細(xi)胞介(jie)素 6（IL-6）、IL-10 水平(ping)，流式(shi)細(xi)胞儀測定細(xi)胞雕(diao)亡率(lv)，免(mian)疫蛋白(bai)質(zhi)印(yin)記（Western blot）技術測定緊(jin)密(mi)連接蛋白(bai)閉(bi)合蛋白(bai)（occludin）和(he)緊(jin)密(mi)黏(nian)連蛋白(bai) 1（ZO-1）表(biao)達(da)水平(ping)。

研究(jiu)結(jie)果：與(yu)空(kong)白(bai)對(dui)照組相比(bi)，TNF-α 模(mo)型組 TER、FITC-dextran、occludin 和(he) ZO-1 表達(da)水平(ping)均(jun)明(ming)顯下降，IL-6、IL-10、細(xi)胞雕(diao)亡率(lv)明(ming)顯升(sheng)高(gao)；與(yu) TNF-α 模(mo)型組比(bi)較(jiao)，經 UTI 處(chu)理後，TER、FITC-dextran、occludin 和(he) ZO-1 表達(da)水平(ping)升(sheng)高(gao)，IL-6、IL-10、細(xi)胞雕(diao)亡率(lv)降低，其中(zhong)以(yi) UTI 高(gao)劑量(liang)組變化(hua)為主(zhu)。

五、十(shi)溴(xiu)聯苯(ben)醚(mi)對血(xue)腦屏障(zhang)體外(wai)模(mo)型通(tong)透性(xing)的(de)影(ying)響(xiang)

研(yan)究(jiu)目(mu)的(de)：觀(guan)察(cha)十溴聯(lian)苯(ben)醚(mi)（BDE-209）對血(xue)腦屏障(zhang)體外(wai)模(mo)型通(tong)透性(xing)的(de)影(ying)響(xiang)。

實驗(yan)方法：利(li)用(yong)小鼠(shu)腦微血管內(nei)皮細(xi)胞 bEnd.3 與(yu)星形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞構(gou)建非接觸(chu)共(gong)培養血腦屏障(zhang)體外(wai)模(mo)型，ERS 電(dian)阻儀測定跨(kua)內(nei)皮(pi)細(xi)胞電(dian)阻值（TEER）確定建模(mo)成功(gong)，采用(yong) CCK-8 法檢測 bEnd.3 細(xi)胞活性(xing)並(bing)確定 50μmol/L 為 BDE-209 最(zui)大(da)劑(ji)量(liang)；將(jiang) 0、10、25、50μmol/L 的(de) BDE-209 作(zuo)用(yong)於血(xue)腦屏障(zhang)體外(wai)模(mo)型中(zhong)的(de) bEnd.3 細(xi)胞 24h，采用(yong) ERS 電(dian)阻儀測定 TEER，HRP 滲(shen)透實驗(yan)評價模(mo)型大分子物(wu)質(zhi)通(tong)透性(xing)，免疫印(yin)跡(ji)法檢測 bEnd.3 細(xi)胞緊(jin)密(mi)連接蛋白(bai) occludin 表(biao)達(da)。

研究(jiu)結(jie)果：隨著(zhe) BDE-209 濃度增加(jia)，TEER 逐(zhu)漸下降，HRP 滲透逐(zhu)漸增(zeng)多，bEnd.3 細(xi)胞 occludin 蛋白(bai)表(biao)達(da)量(liang)逐(zhu)漸降低。結(jie)論為 BDE-209 可(ke)致(zhi)血(xue)腦屏障(zhang)體外(wai)模(mo)型 TEER 降低，HRP 滲透增高(gao)，occludin 蛋白(bai)表(biao)達(da)減少(shao)，血腦屏障(zhang)的(de)完(wan)整性(xing)破(po)壞。

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