細(xi)胞培(pei)養的無(wu)菌操作基(ji)本技術(shu)

細(xi)胞培(pei)養是壹項(xiang)需(xu)要(yao)嚴格無(wu)菌操作的實驗技術(shu)，以下(xia)是關於細胞培(pei)養的無(wu)菌操作基(ji)本技術(shu)、實驗用(yong)品(pin)、培(pei)養基(ji)、抗生(sheng)素和血清等方面(mian)的總(zong)結(jie)。

壹、無(wu)菌操作基(ji)本技術(shu)

1. 實驗前準備：

   - 無(wu)菌室(shi)及無(wu)菌操作臺(tai)以紫外(wai)燈照射(she) 30 - 60 分(fen)鐘(zhong)滅菌，用(yong) 70% 乙醇(chun)擦拭無(wu)菌操作臺(tai)面(mian)，並(bing)開啟(qi)無(wu)菌操作臺(tai)風扇運轉 10 分(fen)鐘(zhong)後(hou)開始實驗操作。

   - 每(mei)次操(cao)作只處(chu)理(li)壹株(zhu)細(xi)胞株(zhu)，不(bu)共享培(pei)養基(ji)，避免(mian)失誤(wu)混淆(xiao)或(huo)細(xi)胞間(jian)汙(wu)染。實驗完畢後(hou)，用(yong) 70%乙醇(chun)擦拭無(wu)菌操作臺(tai)面(mian)。操(cao)作間(jian)隔應(ying)讓(rang)無(wu)菌操作臺(tai)運轉(zhuan) 10 分(fen)鐘(zhong)以上，再(zai)進(jin)行(xing)下(xia)壹個(ge)細(xi)胞株(zhu)操作。

2. 操(cao)作區(qu)域要(yao)求(qiu)：

   - 無(wu)菌操作工作區(qu)域應(ying)保持(chi)清潔及(ji)寬敞(chang)，必要(yao)物(wu)品(pin)可(ke)暫(zan)時(shi)放置，其(qi)它(ta)實驗用(yong)品(pin)用(yong)完即(ji)移出(chu)，以利於氣流(liu)流(liu)通(tong)。

   - 實驗用(yong)品(pin)以 70%乙醇(chun)擦拭後(hou)帶(dai)入無(wu)菌操作臺(tai)，實驗操作應(ying)在(zai)臺(tai)面(mian)中(zhong)央(yang)無(wu)菌區(qu)域，勿(wu)在(zai)邊緣(yuan)非無(wu)菌區(qu)域操作。

3. 取(qu)用(yong)物品(pin)註意(yi)事項：

   - 小(xiao)心(xin)取用(yong)無(wu)菌實驗物品(pin)，避免(mian)造成(cheng)汙(wu)染。勿(wu)碰(peng)觸吸管尖(jian)頭部(bu)或(huo)容(rong)器瓶(ping)口，不(bu)在(zai)打(da)開的容(rong)器正(zheng)上方操(cao)作實驗。

   - 容(rong)器打(da)開後(hou)，以手(shou)夾(jia)住瓶(ping)蓋(gai)並(bing)握住瓶(ping)身，傾(qing)斜約(yue) 45°角(jiao)取(qu)用(yong)，盡(jin)量(liang)勿(wu)將瓶(ping)蓋(gai)蓋(gai)口朝(chao)上放置桌(zhuo)面(mian)。

4. 工(gong)作人員(yuan)安(an)全(quan)：

   - 工(gong)作人員(yuan)應(ying)穿戴(dai)實驗衣及(ji)手(shou)套(tao)後(hou)進(jin)行(xing)實驗。對於來(lai)自(zi)人類(lei)或(huo)病毒(du)感(gan)染(ran)的細(xi)胞株(zhu)應(ying)特(te)別小(xiao)心(xin)操作，並(bing)選擇(ze)適(shi)當(dang)等級(ji)的無(wu)菌操作臺(tai)（至少 Class II）。

   - 操(cao)作過程(cheng)中，避免(mian)引起 aerosol 產(chan)生(sheng)，小(xiao)心(xin)毒(du)性(xing)藥(yao)品(pin)如(ru) DMSO 及(ji) TPA 等，避免(mian)尖(jian)銳(rui)針(zhen)頭傷(shang)害(hai)。

5. 定期(qi)檢測項(xiang)目(mu)：

   - 檢測 CO2 鋼(gang)瓶(ping)的 CO2 壓(ya)力(li)。

   - 檢測 CO2 培(pei)養箱的 CO2 濃度(du)、溫(wen)度(du)及(ji)水(shui)盤(pan)是否(fou)有汙(wu)染（水(shui)盤(pan)的水(shui)用(yong)無(wu)菌水，每(mei)周更(geng)換(huan)）。

   - 檢測無(wu)菌操作臺(tai)內(nei)的 airflow 壓(ya)力(li)，定期(qi)更換(huan)紫外(wai)線(xian)燈管及(ji) HEPA 過濾(lv)膜、預濾(lv)網（300 小(xiao)時/預濾(lv)網，3000 小(xiao)時 /HEPA）。

6. 水(shui)槽(cao)處理(li)：

   - 水(shui)槽(cao)可添(tian)加消毒(du)劑(ji)（Zephrin 1:750），定期(qi)更換(huan)水槽(cao)的水(shui)。

二、實驗用(yong)品(pin)

1. 種類：

   - 細(xi)胞培(pei)養實驗用(yong)品(pin)均(jun)為無(wu)菌，除玻(bo)璃(li)容(rong)器與 pasteur pipet 外(wai)，其它(ta)均為塑料(liao)無(wu)菌制品(pin)。

   - TC 級(ji)培(pei)養盤(pan)表面(mian)有(you) coating 高分子(zi)物(wu)質以讓細胞吸(xi)附，培(pei)養容(rong)器種類有(you) Tflask 、plates、dishes、roller bottle 等，依實驗需(xu)要(yao)使(shi)用(yong)。

   - 塑料(liao)無(wu)菌吸管(guan)：1 ml、2 ml、 5 ml、10 ml、25 ml。

   - 塑料(liao)離心(xin)管：15 ml、50 ml，有(you)兩種不(bu)同材(cai)質， polypropylene（PP）為不(bu)透(tou)明材(cai)質，polystyrene（ PS ）為透明材(cai)質，可依(yi)實驗需(xu)要(yao)選擇(ze)。

   - glass pastuer pipet：9 inch，用(yong)於抽(chou)掉(diao)廢(fei)棄(qi)培(pei)養液等。

   - 玻(bo)璃(li)血清瓶(ping)：100 ml、250 ml、 500 ml、1000 ml。

2. 清洗：

   - 新(xin)購(gou)玻璃血清瓶(ping)先(xian)以 0.1 - 0.05 N HCl 浸(jin)泡(pao)數(shu)小(xiao)時，洗凈(jing)後(hou)使(shi)用(yong)。

   - 用(yong)過的玻(bo)璃(li)血清瓶(ping)，高壓(ya)蒸汽滅菌，洗凈(jing)後(hou)分(fen)別(bie)用(yong)壹次與二次去離(li)子(zi)水沖(chong)洗幹凈(jing)，勿(wu)加清潔劑(ji)清洗。

3. 滅菌：

   - 實驗用(yong)玻璃(li)血清瓶(ping)以鋁箔紙包覆瓶(ping)蓋(gai)，高壓(ya)蒸汽滅菌 121 oC，15 lb ，20 分(fen)鐘(zhong)，置於(yu) oven 中(zhong)烘(hong)幹。

   - 實驗用(yong)玻璃(li) pasteur pipet 以幹熱滅菌 170 oC ，4 小(xiao)時。

   - 液(ye)體或(huo)固體廢(fei)棄(qi)物可(ke)用(yong) 10% hypochloride 溶(rong)液(ye)（次氯(lv)酸(suan)，即漂(piao)白水）或(huo)蒸汽高壓(ya)滅菌 121 oC ，15 lb，20 分(fen)鐘(zhong)處理(li)。

三(san)、培(pei)養基(ji)

1. 貯(zhu)存與使用(yong)：

   - 液(ye)體培(pei)養基(ji)貯存於(yu) 4 oC 冰(bing)箱(xiang)，避免(mian)光照，實驗進行(xing)前放在(zai) 37 oC 水(shui)槽(cao)中溫(wen)熱。

   - 液(ye)體培(pei)養基(ji)（加血清）存放期(qi)為六個(ge)月，期(qi)間(jian) glutamine 可(ke)能(neng)會(hui)分解(jie)，若(ruo)細胞生(sheng)長(chang)不(bu)佳，可(ke)添加適(shi)量(liang) glutamine 。

2. 粉(fen)末培(pei)養基(ji)配制(zhi)：

   - 粉(fen)末培(pei)養基(ji)之配(pei)制體積(ji)為 900 ml，pH 為 7.2 - 7.4，須(xu)添加 10%血清。NaHCO3 為另外(wai)添加，應(ying)分(fen)別溶解(jie)粉(fen)末培(pei)養基(ji)及 NaHCO3 粉(fen)末後(hou)再(zai)混合(he)，用(yong) CO2 氣(qi)體調(tiao)整(zheng) pH。

   - 材(cai)料(liao)包括純(chun)水(shui)、粉末培(pei)養基(ji)、NaHCO3、電(dian)磁(ci)攪拌器、無(wu)菌血清瓶(ping)、無(wu)菌過濾(lv)膜、pH meter 、真(zhen)空(kong)幫浦(pu)、CO2 氣(qi)體等。

   - 步(bu)驟(zhou)為溶解(jie)粉(fen)末培(pei)養基(ji)、溶解(jie) NaHCO3 粉(fen)末並(bing)通入 CO2 氣(qi)體至飽(bao)和、混合(he)兩種溶液(ye)、調整(zheng) pH、過濾(lv)滅菌、分裝(zhuang)並(bing)貯存於(yu) 4 oC，同時(shi)配制之培(pei)養基(ji)需(xu)作生長(chang)試驗與汙(wu)染測試。

3. 配(pei)制(zhi)培(pei)養基(ji)之生(sheng)長(chang)測試：

   - 材(cai)料(liao)有 MDCK cell、6-well TC plate 、methanol、glacial acetic acid、10% Giemsa solution 。

   - 步(bu)驟(zhou)包(bao)括培(pei)養 MDCK cell、觀(guan)察(cha)細胞群落生(sheng)長(chang)、固定細胞、染(ran)色(se)、計數(shu)群落數(shu)並(bing)比(bi)較，若(ruo)新(xin)配制(zhi)或(huo)新(xin)批號(hao)培(pei)養基(ji)對細胞生(sheng)長(chang)不(bu)佳則(ze)丟棄。

四、抗生素

1. 細(xi)胞庫之細胞培(pei)養基(ji)不(bu)加抗(kang)生(sheng)素(su)，培(pei)養自(zi) ATCC 引進之細胞株(zhu)，培(pei)養基(ji)中不(bu)加抗(kang)生(sheng)素(su)；培(pei)養自(zi)其(qi)它(ta)實驗室(shi)引進之細胞株(zhu)，制作 token freeze 前培(pei)養基(ji)須(xu)添加抗(kang)生(sheng)素(su)，通(tong)過汙(wu)染測試後(hou)大(da)量(liang)培(pei)養時不(bu)加抗(kang)生(sheng)素(su)。

2. 寄(ji)送(song)活(huo)細胞時(shi)，須(xu)將培(pei)養液充滿(man)整(zheng)個(ge) flask 時(shi)，則(ze)須(xu)添加抗(kang)生(sheng)素(su)（penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml ）。

3. 若(ruo)要(yao)檢測 mycoplasma，則(ze)培(pei)養基(ji)內(nei)不(bu)可(ke)添加 gentamicin，因(yin) gentamicin 會(hui)抑制(zhi) mycoplasma 生(sheng)長(chang)。

4. 去除(chu)細(xi)菌汙(wu)染之(zhi)抗(kang)生(sheng)素混合(he)配方為 penicillin 250 units/ml，streptomycin 250 ug/ml ，neomycin 250 ug/ml，bacitracin 2.5 units/ml，註意(yi)混合(he)使用(yong)後(hou)藥(yao)物(wu)毒(du)性(xing)會(hui)增強。

5. 表中列(lie)出(chu)了不(bu)同抗(kang)生素的使(shi)用(yong)種類、工(gong)作濃度(du)、儲(chu)存溫(wen)度(du)及(ji)殺(sha)滅細菌類型(xing)。

五(wu)、血清

1. 貯(zhu)存要(yao)求(qiu)：

   - 血清必須(xu)貯存於(yu)–20 ～ -70 oC，若(ruo)存放於(yu) 4℃，請(qing)勿(wu)超(chao)過壹個(ge)月。

   - 可(ke)將血清分裝(zhuang)於(yu)無(wu)菌 50 ml 離(li)心(xin)管中(zhong)，預留(liu)血清結(jie)凍時(shi)體積(ji)增加約(yue) 10% 的空(kong)間(jian)，否(fou)則易發(fa)生(sheng)汙(wu)染或(huo)容(rong)器凍裂(lie)。

2. 處(chu)理(li)方(fang)法(fa)：

   - 壹般廠商提(ti)供(gong)之血清為無(wu)菌，不(bu)需(xu)再(zai)無(wu)菌過濾(lv)。若(ruo)發(fa)現(xian)血清有許多懸(xuan)浮(fu)物，可將血清加入培(pei)養基(ji)內(nei)壹起過濾(lv)，勿(wu)直(zhi)接過濾(lv)血清。

3. 解(jie)凍(dong)步驟(zhou)：

   - 瓶(ping)裝(zhuang)血清采用(yong)逐步(bu)解(jie)凍(dong)法(fa)，從(cong)–20 oC 或(huo)–70 oC 至 4 oC 冰(bing)箱(xiang)溶解(jie)壹天(tian)，至室(shi)溫下(xia)全(quan)溶(rong)後(hou)再(zai)分(fen)裝(zhuang)，溶(rong)解(jie)過程(cheng)中須(xu)規(gui)則(ze)搖(yao)晃(huang)均(jun)勻，勿(wu)直(zhi)接由(you)–20 oC 直(zhi)接(jie)至 37 oC 解(jie)凍(dong)。

4. heat-inactivation：

   - 指(zhi) 56 oC，30 分(fen)鐘(zhong)加熱(re)已(yi)解(jie)凍(dong)之血清，目(mu)的是使(shi)血清中之(zhi)補體成(cheng)份去活(huo)化(hua)，除(chu)非必須(xu)，壹般不(bu)建(jian)議(yi)作此(ci)熱(re)處(chu)理(li)，會(hui)造成(cheng)沈澱(dian)物(wu)增多且影響血清品(pin)質。

5. 註意(yi)事項：

   - 勿(wu)將血清置於(yu) 37 oC 太久，否(fou)則血清會(hui)變得(de)混濁(zhuo)，影響血清品(pin)質。

6. 血清之沈澱(dian)物(wu)：

   - 凝(ning)絮(xu)物(wu)：由(you)血清中之(zhi)脂蛋(dan)白變性及(ji)解(jie)凍(dong)後(hou)血清中存在(zai)之(zhi)血纖維蛋白造成(cheng)，可用(yong)離心(xin)去除(chu)，或(huo)離(li)心(xin)後(hou)上清液加入培(pei)養基(ji)中壹起過濾(lv)，不(bu)建(jian)議(yi)用(yong)過濾(lv)步驟(zhou)去除(chu)，以免阻塞過濾(lv)膜。

   - 顯(xian)微(wei)鏡下(xia)觀(guan)察(cha)之“小(xiao)黑點"：通常經(jing)過熱處理(li)的血清沈澱(dian)物(wu)會(hui)顯著(zhu)增多，這(zhe)些(xie)小(xiao)黑點壹般不(bu)會(hui)影響細胞生(sheng)長(chang)，但若(ruo)懷(huai)疑(yi)血清品(pin)質，應(ying)立(li)即停用(yong)，更換(huan)另壹批(pi)號(hao)血清。

7. 血清之生(sheng)長(chang)測試：

   - 材(cai)料(liao)有 MDCK cell、a-MEM、 6-well TC plate、methanol、glacial acetic acid 、 10% Giemsa solution。

   - 步(bu)驟(zhou)包(bao)括培(pei)養 MDCK cell 至 80% confluency 、處(chu)理(li)細(xi)胞制(zhi)成(cheng)懸浮(fu)液並(bing)測濃度(du)、接(jie)種細胞入 6-well plate 並(bing)加入不(bu)同濃度(du)血清的 a-MEM、培(pei)養、固定、染色(se)、計數(shu)群落數(shu)、計(ji)算 SPE 和 RPE，比(bi)較各(ge)濃度(du)血清培(pei)養基(ji)之 RPE，可(ke)知(zhi)待(dai)測血清對細胞生(sheng)長(chang)的影響。同時(shi)，可訂(ding)購(gou)多量(liang)同壹批(pi)號(hao)的優(you)良(liang)血清，置於(yu)– 70 oC 保存。

更(geng)多細(xi)胞培(pei)養耗(hao)材(cai)、實驗室(shi)儀器、實驗試劑(ji)等可以進入蘇(su)州阿(e)爾(er)法(fa)生物(wu)進行(xing)了解(jie)。