PCR 反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)與(yu)反(fan)應條件是(shi)什(shen)麽(me)？

聚(ju)合(he)酶鏈(lian)式反(fan)應（PCR）作為壹種強大的(de)分(fen)子(zi)生物學技術，在生命(ming)科學研(yan)究(jiu)、醫(yi)學研(yan)究(jiu)、法醫(yi)學等(deng)眾(zhong)多(duo)領(ling)域(yu)都發(fa)揮(hui)著至(zhi)關(guan)重要(yao)的(de)作(zuo)用(yong)。深入(ru)了解 PCR 反應體系(xi)與(yu)反(fan)應條件，對(dui)於(yu)準(zhun)確(que)、高(gao)效地進行(xing)實驗(yan) 非常重要(yao)。

壹(yi)、標(biao)準的(de) PCR 反應(ying)體系(xi)

標(biao)準的(de) PCR 反應(ying)體系(xi)包含(han)多個(ge)關(guan)鍵成(cheng)分(fen)。主(zhu)要(yao)有：

10×擴增(zeng)緩沖(chong)液(ye)，它為反應(ying)提(ti)供(gong)穩定的化學環(huan)境。4 種 dNTP 混合(he)物，即(ji)脫(tuo)氧核糖(tang)核苷三(san)磷酸(suan)（包括(kuo) dATP、dCTP、dGTP、dTTP），各以 200umol/L 的濃(nong)度(du)存(cun)在於(yu)體(ti)系(xi)中(zhong)，為 DNA 合(he)成提(ti)供(gong)原(yuan)料(liao)。引(yin)物是(shi) PCR 特(te)異(yi)性(xing)反(fan)應(ying)的關(guan)鍵，各 10～100pmol 的引(yin)物決定了擴增(zeng)的起(qi)始(shi)位置和(he)方向。模(mo)板 DNA 的量(liang)通(tong)常(chang)在 0.1～2ug 之間(jian)，它(ta)是待擴增(zeng)的目(mu)標(biao) DNA 片段(duan)。Taq DNA 聚合(he)酶以 2.5u 的量(liang)參(can)與(yu)反(fan)應，催化(hua) DNA 合(he)成。Mg2+濃(nong)度為 1.5mmol/L，它對(dui) PCR 反應(ying)的(de)特(te)異(yi)性(xing)和(he)產(chan)量(liang)有顯(xian)著影(ying)響(xiang)。最後(hou)，通(tong)過(guo)加(jia)入(ru)雙(shuang)或(huo)三(san)蒸(zheng)水(shui)將反應體系(xi)調整至(zhi) 100ul。

二(er)、PCR 反應(ying)五(wu)要素(su)

PCR 反(fan)應主要(yao)由五(wu)種物質(zhi)組成(cheng)，即(ji)引(yin)物、酶(mei)、dNTP、模板和(he) Mg2+。

引(yin)物是(shi)決定 PCR 特(te)異(yi)性(xing)的(de)關(guan)鍵因素(su)。其長(chang)度通(tong)常(chang)在 15 - 30bp 之間(jian)，20bp 左(zuo)右(you)較為常用(yong)。合(he)適的(de)引(yin)物長(chang)度有助(zhu)於(yu)確(que)保特(te)異(yi)性(xing)結合(he)和(he)高(gao)效擴增(zeng)。引(yin)物擴增(zeng)跨度以 200 - 500bp 為宜，這(zhe)樣(yang)可(ke)以在保證(zheng)特(te)異(yi)性(xing)的(de)同時，實(shi)現(xian)對(dui)目(mu)標(biao)片段(duan)的有效擴增(zeng)。引(yin)物堿(jian)基(ji)中(zhong) G + C 含(han)量以 40 - 60%為宜，ATGC 最好隨(sui)機分(fen)布(bu)，避免(mian)出現連(lian)續(xu)的 5 個(ge)以上的嘌呤或(huo)嘧(mi)啶(ding)核苷酸(suan)成串(chuan)排(pai)列，以減(jian)少(shao)非特(te)異(yi)性(xing)結合(he)的風(feng)險。同時，要(yao)避免(mian)引(yin)物內部(bu)出現二(er)級結構以及兩條引(yin)物間(jian)互補，防止(zhi)形(xing)成引(yin)物二(er)聚體(ti)。引(yin)物 3`端的(de)堿(jian)基(ji)應(ying)嚴格要求(qiu)配(pei)對(dui)，否(fou)則可(ke)能導致(zhi) PCR 失(shi)敗。

此(ci)外，引(yin)物中(zhong)有或(huo)能加上合(he)適的(de)酶切位點(dian)，對(dui)於(yu)後(hou)續(xu)的(de)酶切分(fen)析(xi)或(huo)分(fen)子(zi)克隆非常有好處(chu)。並(bing)且引(yin)物應(ying)與(yu)核酸(suan)序列數(shu)據(ju)庫(ku)的(de)其它(ta)序(xu)列無明顯同源(yuan)性(xing)，以確(que)保特(te)異(yi)性(xing)。引(yin)物濃(nong)度也需(xu)謹(jin)慎控制，以低引(yin)物量(liang)產生(sheng)所需(xu)要的結果(guo)為好，濃(nong)度(du)偏高(gao)會引(yin)起錯(cuo)配(pei)和(he)非特(te)異(yi)性(xing)擴增(zeng)，還會(hui)增(zeng)加引(yin)物之(zhi)間形(xing)成二(er)聚體(ti)的(de)機會。

酶在 PCR 反應(ying)中(zhong)起著核心作(zuo)用(yong)。目(mu)前主要(yao)有兩(liang)種 Taq DNA 聚合(he)酶供(gong)應，壹種是從(cong)棲熱(re)水(shui)生桿(gan)菌中(zhong)提(ti)純(chun)的天(tian)然酶(mei)，另壹(yi)種為大腸菌合(he)成的(de)基(ji)因工程酶。催(cui)化壹(yi)典型的 PCR 反應約(yue)需(xu)酶量 2.5U（指總反(fan)應(ying)體積(ji)為 100ul 時），濃(nong)度(du)過高(gao)可(ke)引(yin)起非特(te)異(yi)性(xing)擴增(zeng)，濃度(du)過低則合(he)成產(chan)物量(liang)減(jian)少(shao)。

dNTP 即(ji)脫(tuo)氧核糖(tang)核苷三(san)磷酸(suan)，在 PCR 反應(ying)中(zhong)為 DNA 合(he)成提(ti)供(gong)原(yuan)料(liao)。dNTP 粉呈顆粒(li)狀，保存(cun)不(bu)當(dang)易變(bian)性(xing)失(shi)去(qu)生物(wu)學活性(xing)。應(ying)配(pei)成(cheng)高(gao)濃度(du)後(hou)，以 1M NaOH 或(huo) 1M Tris.HCL 的(de)緩(huan)沖(chong)液(ye)將其 PH 調(tiao)節(jie)到 7.0～7.5，小(xiao)量分(fen)裝(zhuang)，-20℃冰(bing)凍(dong)保存(cun)。在 PCR 反應(ying)中(zhong)，dNTP 應為 50～200umol/L，並(bing)且 4 種 dNTP 的濃(nong)度要(yao)相(xiang)等(deng)，任(ren)何壹(yi)種濃度(du)不(bu)同於(yu)其它(ta)幾(ji)種時（偏高(gao)或(huo)偏低），就會(hui)引(yin)起錯(cuo)配(pei)。濃(nong)度(du)過(guo)低(di)會降低 PCR 產(chan)物的產量，而(er)濃(nong)度(du)過高(gao)又(you)會與(yu) Mg2+結合(he)使遊(you)離(li)的(de) Mg2+濃度(du)降(jiang)低(di)。

模(mo)板 DNA 是 PCR 反(fan)應的(de)目(mu)標(biao)。傳(chuan)統(tong)的 DNA 純化方法通(tong)常(chang)采(cai)用(yong) SDS 和(he)蛋(dan)白(bai)酶 K 來消(xiao)化(hua)處(chu)理(li)標(biao)本(ben)，提(ti)取的核酸(suan)即(ji)可(ke)作(zuo)為模板用(yong)於(yu) PCR 反(fan)應(ying)。對(dui)於(yu)壹(yi)般(ban)臨(lin)床檢測(ce)標(biao)本(ben)，可(ke)采(cai)用(yong)快速(su)簡便(bian)的方法溶(rong)解細胞(bao)，裂(lie)解病(bing)原(yuan)體(ti)，消(xiao)化(hua)除(chu)去(qu)染色體的(de)蛋白(bai)質(zhi)使靶(ba)基(ji)因遊(you)離(li)，直(zhi)接用(yong)於(yu) PCR 擴增(zeng)。RNA 模板提(ti)取壹般采用(yong)異硫氰酸(suan)胍或(huo)蛋(dan)白(bai)酶 K 法，同時要(yao)特(te)別(bie)註(zhu)意防止(zhi) RNase 降(jiang)解 RNA。

Mg2+對(dui) PCR 擴增(zeng)的特(te)異(yi)性(xing)和(he)產(chan)量(liang)有較大影(ying)響(xiang)。在壹般(ban)的(de) PCR 反應中(zhong)，各種 dNTP 濃度(du)為 200umol/L 時，Mg2+濃(nong)度(du)為 1.5～2.0mmol/L 為宜。Mg2+濃(nong)度過高(gao)，反應(ying)特(te)異(yi)性(xing)降(jiang)低(di)，出現非特(te)異(yi)擴增(zeng)；濃度(du)過低會降低 Taq DNA 聚(ju)合(he)酶的(de)活性(xing)，使反(fan)應(ying)產物減(jian)少(shao)。

三(san)、PCR 反應條件設置

PCR 反(fan)應基(ji)於(yu)原(yuan)理(li)三步(bu)驟(zhou)而(er)設置變(bian)性(xing) - 退(tui)火(huo) - 延伸三(san)個(ge)溫度(du)點(dian)。對(dui)於(yu)較短(duan)靶(ba)基(ji)因可(ke)采(cai)用(yong)二(er)溫度(du)點(dian)法。

變(bian)性(xing)是(shi) PCR 反應(ying)的壹步(bu)驟(zhou)，其目(mu)的是使雙(shuang)鏈 DNA 解鏈為單鏈(lian)。變(bian)性(xing)溫度(du)壹般(ban)為 93℃～94℃，時間(jian)為 1min。變(bian)性(xing)溫度(du)低，解鏈不(bu)全(quan)是(shi)導(dao)致(zhi) PCR 失(shi)敗的(de)最主(zhu)要(yao)原(yuan)因。但溫度(du)也不(bu)能過高(gao)，因為高(gao)溫環(huan)境對(dui)酶的(de)活性(xing)有影(ying)響(xiang)。

退(tui)火(huo)是(shi)第(di)2步(bu)，在這(zhe)壹步(bu)引(yin)物與(yu)模(mo)板發生(sheng)結合(he)。退(tui)火(huo)溫度(du)取決於(yu)引(yin)物的(de)長(chang)度、堿基(ji)組(zu)成(cheng)及其濃(nong)度(du)，還有靶(ba)基(ji)序(xu)列的長(chang)度。對(dui)於(yu) 20 個(ge)核苷酸(suan)，G+C 含(han)量約(yue) 50%的(de)引(yin)物，55℃為選擇(ze)最適(shi)退(tui)火(huo)溫度(du)的起(qi)點(dian)較為理(li)想(xiang)。退(tui)火(huo)溫度(du)可(ke)通(tong)過(guo)公(gong)式 Tm 值(zhi)(解鏈溫度(du))=4(G+C)＋2(A+T)，復(fu)性溫度(du)=Tm 值(zhi)-(5～10℃)來幫(bang)助(zhu)選擇(ze)合(he)適的(de)溫度(du)。在 Tm 值(zhi)允許(xu)範(fan)圍(wei)內，選(xuan)擇(ze)較高(gao)的復(fu)性溫度(du)可(ke)大大減(jian)少(shao)引(yin)物和(he)模(mo)板間的(de)非特(te)異(yi)性(xing)結合(he)，提(ti)高(gao) PCR 反應(ying)的(de)特(te)異(yi)性(xing)。復(fu)性時間(jian)壹(yi)般為 30～60sec，足以使引(yin)物與(yu)模(mo)板之間(jian)相結合(he)。

接下(xia)來(lai)是(shi)延伸，在 Taq DNA 聚合(he)酶的(de)作用(yong)下，使引(yin)物鏈(lian)沿(yan)模(mo)板延伸。延伸溫度(du)壹般(ban)選(xuan)擇(ze)在 70～75℃之間(jian)，常(chang)用(yong)溫度(du)為 72℃。過高(gao)的延伸溫度(du)不(bu)利於(yu)引(yin)物和(he)模(mo)板的結合(he)。延伸時間(jian)可(ke)根(gen)據(ju)待(dai)擴增(zeng)片段(duan)的長(chang)度而(er)定，壹般 1Kb 以內的(de) DNA 片段(duan)，延伸時間(jian) 1min 是(shi)足夠的。3～4kb 的(de)靶(ba)序(xu)列需(xu) 3～4min；擴增(zeng) 10Kb 需(xu)延伸至(zhi) 15min。延伸進(jin)間(jian)過長(chang)會導致非特(te)異(yi)性(xing)擴增(zeng)帶的(de)出現。對(dui)低濃(nong)度(du)模(mo)板的擴增(zeng)，延伸時間(jian)要(yao)稍長(chang)些。

總(zong)之，準(zhun)確(que)理(li)解和(he)掌(zhang)握 PCR 反應體系(xi)與(yu)反(fan)應條件，對(dui)於(yu)成(cheng)功(gong)進(jin)行(xing) PCR 實驗(yan)至(zhi)關(guan)重要(yao)。只(zhi)有在合(he)適的(de)反應(ying)體系(xi)和(he)條(tiao)件下(xia)，才(cai)能實現(xian)高(gao)效、特(te)異(yi)性(xing)的(de) DNA 擴增(zeng)，為後續(xu)的研(yan)究(jiu)和(he)應(ying)用(yong)提(ti)供(gong)可(ke)靠(kao)的基(ji)礎(chu)。   

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