測(ce)序(xu)儀(yi)和PCR儀(yi)有(you)什麽(me)不同(tong)？

 測(ce)序(xu)儀(yi)和PCR儀(yi)是(shi)現代(dai)分子(zi)生物(wu)學實驗(yan)中重(zhong)要(yao)的(de)實驗(yan)室儀(yi)器，它(ta)們在(zai)基(ji)因(yin)研(yan)究(jiu)和核酸檢(jian)測(ce)等領(ling)域發(fa)揮著重(zhong)要(yao)作(zuo)用(yong)。雖然兩者都(dou)與 DNA相(xiang)關，但(dan)它(ta)們的(de)功能和原(yuan)理卻大相(xiang)徑庭(ting)。測(ce)序(xu)儀(yi)和PCR儀(yi)有(you)什麽(me)不同(tong)？

壹、工作(zuo)原(yuan)理

1. PCR儀(yi)（聚合(he)酶(mei)鏈(lian)式(shi)反應(ying)儀）工作(zuo)原(yuan)理

PCR儀(yi)的(de)主(zhu)要(yao)功能是進行(xing)聚合(he)酶(mei)鏈(lian)式(shi)反應(ying)（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR），這(zhe)是(shi)壹種在(zai)體外模擬DNA自然復制的(de)過(guo)程(cheng)。PCR儀(yi)通過(guo)控制溫度(du)變化，使DNA樣本在(zai)以下(xia)幾個階(jie)段循環：

（1）變性：將雙鏈(lian)DNA加熱(re)至(zhi)94-98℃，使DNA雙鏈(lian)分離(li)成單(dan)鏈(lian)。

（2）退火(huo)：將(jiang)溫度(du)降(jiang)至50-65℃，使引物(wu)與單(dan)鏈DNA模板(ban)結合(he)。

（3）延伸：將溫度(du)升至(zhi)72℃，DNA聚合(he)酶(mei)開(kai)始沿(yan)著引(yin)物(wu)方向合(he)成新(xin)的(de)DNA鏈。

通過(guo)這(zhe)三個階(jie)段的(de)循環，PCR儀(yi)可(ke)以在(zai)短時間(jian)內(nei)實現DNA的(de)指(zhi)數(shu)級擴(kuo)增(zeng)。

2. 測(ce)序(xu)儀(yi)工(gong)作(zuo)原(yuan)理

目前(qian)常(chang)用(yong)的(de)測(ce)序(xu)技術是Sanger測(ce)序(xu)和二代(dai)測(ce)序(xu)（Next-Generation Sequencing, NGS）。

Sanger測(ce)序(xu)（第壹代(dai)測(ce)序(xu)技術）

• Sanger測(ce)序(xu)是(shi)壹(yi)種鏈終止法(fa)，其(qi)基本原(yuan)理如(ru)下(xia)：

• DNA模板(ban)準(zhun)備(bei)：先需(xu)要(yao)將待(dai)測(ce)序(xu)的(de)DNA片(pian)段克(ke)隆(long)到適(shi)當的(de)載體中，並(bing)通過(guo)PCR擴增(zeng)出大(da)量的(de)單鏈(lian)DNA模板(ban)。

• 測(ce)序(xu)反(fan)應(ying)混合(he)物(wu)的(de)制備：將DNA模板(ban)與四(si)種不同的(de)脫(tuo)氧核糖核苷酸（dNTPs）、適量(liang)的(de)DNA聚合(he)酶(mei)和壹(yi)種(zhong)或(huo)多(duo)種帶(dai)有不同熒光標(biao)記的(de)鏈終(zhong)止(zhi)核苷酸（ddNTPs）混合(he)。

• 鏈(lian)延伸與終(zhong)止：在(zai)DNA聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)作(zuo)用(yong)下(xia)，DNA鏈會(hui)不斷地延伸。當鏈終(zhong)止(zhi)核苷酸（ddNTPs）被加(jia)入(ru)到(dao)正(zheng)在(zai)延伸的(de)DNA鏈中時(shi)，由(you)於它(ta)沒有3’羥(qiang)基，無法形(xing)成磷(lin)酸二酯鍵，導致(zhi)DNA鏈的(de)延伸在(zai)此處終(zhong)止。

• 電(dian)泳(yong)分(fen)離(li)：將測(ce)序(xu)反(fan)應(ying)產物(wu)加載到毛(mao)細(xi)管電泳儀中，通過(guo)電泳(yong)根(gen)據(ju)片(pian)段長(chang)度(du)進行(xing)分離(li)。由於(yu)鏈終止核苷酸帶有(you)不同的(de)熒光標(biao)記，因(yin)此在(zai)電(dian)泳過(guo)程(cheng)中會(hui)發(fa)出不(bu)同顏色(se)的(de)熒光。

• 熒光檢(jian)測(ce)與數(shu)據(ju)分(fen)析：電(dian)泳(yong)過(guo)程(cheng)中，熒光檢(jian)測(ce)器(qi)會(hui)記錄下(xia)熒光信(xin)號(hao)，並(bing)生成測(ce)序(xu)峰圖。通過(guo)分析峰圖，可(ke)以確定(ding)DNA序(xu)列(lie)。

• 
  

二代(dai)測(ce)序(xu)（NGS）

二代(dai)測(ce)序(xu)技術包括(kuo)多(duo)種不(bu)同的(de)平臺(tai)，如(ru)Illumina/Solexa、Roche/454、Ion Torrent等，它(ta)們的(de)工作(zuo)原(yuan)理各(ge)有不同，但(dan)基(ji)本步驟(zhou)相(xiang)似。以下(xia)以Illumina/Solexa平臺(tai)為例(li)解(jie)釋其(qi)工作(zuo)原(yuan)理：

• 文(wen)庫構(gou)建(jian)：將(jiang)待(dai)測(ce)序(xu)的(de)DNA或(huo)RNA片(pian)段化，並(bing)在(zai)片(pian)段兩端添(tian)加(jia)特(te)定(ding)的(de)適配(pei)器(qi)（ adapters ），通過(guo) PCR 擴增(zeng)形成測(ce)序(xu)文(wen)庫。

• 測(ce)序(xu)芯片(pian)加載：將測(ce)序(xu)文(wen)庫加載到測(ce)序(xu)芯片(pian)上，每(mei)個(ge)芯片(pian)上有(you)數(shu)百(bai)萬到數(shu)十(shi)億個(ge)獨立的(de)測(ce)序(xu)反(fan)應(ying)微孔。

• 橋式(shi)PCR擴增(zeng)：在(zai)微(wei)孔中，通過(guo)橋式(shi)PCR擴增(zeng)，使每個微孔中只(zhi)含有壹個特(te)定(ding)的(de) DNA片(pian)段的(de)多(duo)個拷(kao)貝。

• 測(ce)序(xu)循(xun)環：測(ce)序(xu)循(xun)環包(bao)括(kuo)以下(xia)幾個步驟(zhou)：

• 加堿基(ji)：向微(wei)孔中加(jia)入(ru)四(si)種不同的(de)熒光標(biao)記的(de)核苷酸，但(dan)它(ta)們不含有鏈終止(zhi)基(ji)團(tuan)。

• 成像：檢(jian)測(ce)並(bing)記錄每(mei)個(ge)微孔中的(de)熒光信(xin)號(hao)，對(dui)應(ying)於(yu)加入(ru)的(de)核苷酸。

• 化學降(jiang)解(jie)：去除未(wei)結合(he)的(de)核苷酸和熒光標(biao)記，為(wei)下(xia)壹輪(lun)測(ce)序(xu)循(xun)環做(zuo)準(zhun)備(bei)。

• 數據(ju)分(fen)析：通過(guo)分析每(mei)個(ge)循環的(de)熒光信(xin)號(hao)，生成原(yuan)始測(ce)序(xu)數(shu)據(ju)。然後，通過(guo)生物(wu)信息學分析，將(jiang)這(zhe)些數據(ju)轉換成DNA序(xu)列(lie)。

• 二代(dai)測(ce)序(xu)技術因(yin)其(qi)高(gao)通量(liang)、高(gao)效(xiao)率、低成本(ben)的(de)特(te)點(dian)，在(zai)基(ji)因(yin)組(zu)學、轉錄組(zu)學、表(biao)觀遺(yi)傳學等領(ling)域得(de)到(dao)了(le)廣(guang)泛應(ying)用(yong)。

二、PCR儀和測(ce)序(xu)儀(yi)的(de)應用(yong)領域(yu)

1. PCR儀(yi)

PCR儀(yi)廣(guang)泛應(ying)用(yong)於以下(xia)領域(yu)：

（1）基因(yin)克(ke)隆(long)：通過(guo)PCR擴增(zeng)目的(de)基因(yin)片(pian)段，用(yong)於後續(xu)的(de)基因(yin)克(ke)隆(long)、突(tu)變等實驗(yan)。

（2）核酸檢(jian)測(ce)：用(yong)於病(bing)原(yuan)體檢(jian)測(ce)、遺(yi)傳病診(zhen)斷、法醫(yi)學鑒定(ding)等。

（3）基(ji)因(yin)表(biao)達(da)分析：通過(guo)實時熒光定(ding)量(liang)PCR（qPCR）技術，研究(jiu)基因(yin)表(biao)達(da)水平(ping)。

2. 測(ce)序(xu)儀(yi)

測(ce)序(xu)儀(yi)應(ying)用(yong)於以下(xia)領域(yu)：

（1）基因(yin)組(zu)學研究(jiu)：如(ru)人(ren)類(lei)基因(yin)組(zu)計(ji)劃、動(dong)植物(wu)基因(yin)組(zu)測(ce)序(xu)等。

（2）疾(ji)病研(yan)究(jiu)：通過(guo)全(quan)外顯子(zi)組(zu)測(ce)序(xu)、全(quan)基(ji)因(yin)組(zu)測(ce)序(xu)等技術，研究(jiu)遺傳性疾(ji)病(bing)、腫瘤(liu)等疾(ji)病的(de)發(fa)病機(ji)制。

（3）微生物(wu)研究(jiu)：對微(wei)生物(wu)群(qun)落(luo)進行(xing)多(duo)樣性(xing)分析，揭(jie)示(shi)微生物(wu)與環境(jing)的(de)相互關(guan)系(xi)。

PCR儀(yi)和測(ce)序(xu)儀(yi)雖(sui)然都與DNA相(xiang)關，但(dan)它(ta)們的(de)工作(zuo)原(yuan)理和應(ying)用(yong)領域(yu)有(you)很(hen)大差(cha)異(yi)。簡而(er)言(yan)之，PCR儀主(zhu)要(yao)用(yong)於DNA的(de)擴增(zeng)，而(er)測(ce)序(xu)儀(yi)則(ze)用(yong)於測(ce)定(ding)DNA序(xu)列(lie)。

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