Taq DNA聚(ju)合酶(mei)在(zai)PCR技(ji)術(shu)中的應用及(ji)優化(hua)策(ce)略

聚(ju)合酶(mei)鏈(lian)式(shi)反(fan)應（PCR）是壹(yi)種在(zai)生(sheng)物分子(zi)領域(yu)中廣(guang)泛應(ying)用的分子(zi)生(sheng)物學技(ji)術(shu)。Taq DNA聚(ju)合酶(mei)作(zuo)為(wei)PCR反應(ying)中的關鍵(jian)酶(mei)，其(qi)性能直(zhi)接影(ying)響著(zhe)實(shi)驗結果(guo)的準(zhun)確(que)性和可(ke)靠性。本(ben)文(wen)主要(yao)介(jie)紹(shao)了(le)Taq DNA聚(ju)合酶(mei)的來源、特性、活(huo)性定義及(ji)質量(liang)控制(zhi)方法，並探(tan)討了(le)Taq DNA聚(ju)合酶(mei)在(zai)PCR反應中的使用方(fang)法(fa)及(ji)優化(hua)策(ce)略。

壹(yi)、Taq DNA聚(ju)合酶(mei)的來源與(yu)特性

Taq DNA聚(ju)合酶(mei)是壹(yi)種來源於嗜熱(re)菌Thermus aquaticus的耐(nai)熱(re)性DNA聚(ju)合酶(mei)，通(tong)過大(da)腸(chang)桿菌重組表達(da)純化(hua)獲(huo)得。該酶(mei)分子(zi)量為(wei)94kDa，與(yu)天(tian)然Taq DNA聚(ju)合酶(mei)具(ju)有(you)相同的功能。Taq DNA聚(ju)合酶(mei)具(ju)有(you)5'→3'聚(ju)合酶(mei)活(huo)性和5'→3'外切酶(mei)活(huo)性，但無3'→5'外切酶(mei)活(huo)性。這使得PCR產(chan)物的3'端帶(dai)有(you)突(tu)出的A堿基(ji)，便(bian)於克(ke)隆至(zhi)T載(zai)體。

二(er)、Taq DNA聚(ju)合酶(mei)的活(huo)性定義及(ji)質量(liang)控制(zhi)

1. 活(huo)性定義：1個活(huo)性單位(wei)（U）定義為(wei)在(zai)74℃下，30分鐘內(nei)催(cui)化(hua)10 nmol dNTP摻入酸不(bu)溶(rong)物(wu)所(suo)需的酶(mei)量(liang)。

2. 質量(liang)控(kong)制(zhi)：Taq DNA聚(ju)合酶(mei)的蛋白(bai)純度通(tong)過SDS-PAGE凝膠電泳(yong)檢測(ce)，純度不(bu)低(di)於95%。此外，還(hai)需進(jin)行以(yi)下(xia)檢(jian)測(ce)：

（1）核酸內(nei)切酶(mei)活(huo)性檢測(ce)：將(jiang)5 U Taq DNA Polymerase與(yu)200 ng超(chao)螺(luo)旋(xuan)質粒(li)DNA在(zai)37℃下共(gong)同(tong)溫育4小時(shi)，使用瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠電泳(yong)檢測(ce)，少(shao)於(yu)10%的質粒DNA轉變(bian)成(cheng)缺刻或線性狀態(tai)。

（2）非(fei)特異(yi)性核酸酶(mei)活(huo)性檢測(ce)：將(jiang)5 U Taq DNA Polymerase與(yu)15 ng雙鏈(lian)DNA片段在(zai)37℃溫育16小時(shi)，使用瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠電泳(yong)檢測(ce)雙(shuang)鏈(lian)DNA底物(wu)無變化(hua)。

（3）宿主DNA殘留(liu)檢測(ce)：使用大(da)腸(chang)桿菌16S rDNA特異(yi)性引物(wu)探(tan)針(zhen)組，采用熒(ying)光(guang)定量PCR法檢(jian)測(ce)5 U Taq DNA Polymerase，大腸(chang)桿菌宿主基(ji)因組DNA殘留(liu)低(di)於1 copy。

三(san)、Taq DNA聚(ju)合酶(mei)在(zai)PCR反應(ying)中的使用方(fang)法(fa)及(ji)優化(hua)策(ce)略

1. 使用方(fang)法(fa)：

（1）建議(yi)的PCR反應(ying)體系：以(yi)50 μl體系為(wei)例，Taq DNA Polymerase（5 U/μl）0.25 μl，10×Taq Reaction Buffer 5 μl，dNTP（10 mM）1 μl，正向引物(wu)（10 μM）1 μl，反向引物(wu)（10 μM）1 μl，模板(ban)DNA x μl，ddH2O補(bu)至(zhi)50 μl。

（2）常(chang)規(gui)PCR反應(ying)程(cheng)序(xu)：預(yu)變(bian)性94℃ 3~5分鐘，變(bian)性94℃ 30秒(miao)，退(tui)火(huo)55~65℃ 30秒(miao)，延(yan)伸72℃ 30~60秒(miao)/kb，終延(yan)伸(shen)72℃ 5分鐘。

2. 優化(hua)策(ce)略：

（1）引物(wu)設(she)計：引物(wu)長(chang)度建議(yi)設(she)定為(wei)18~25 bp，GC含(han)量為(wei)40%~60%。引物(wu)終(zhong)濃度推薦(jian)為(wei)0.2 μM，效果(guo)不(bu)佳(jia)時(shi)可(ke)以(yi)在(zai)0.1~1 μM進(jin)行調(tiao)整(zheng)。

（2）模板(ban)濃度：不(bu)同模(mo)板(ban)最(zui)佳(jia)反應(ying)濃度有(you)所(suo)不(bu)同。以(yi)基(ji)因組DNA為(wei)模板(ban)時(shi)，壹(yi)般(ban)使用量(liang)應(ying)在(zai)10~400 ng；當(dang)模板(ban)為(wei)質粒(li)或(huo)病毒(du)DNA時(shi)，壹(yi)般(ban)使用量(liang)應(ying)在(zai)10 pg~20 ng。

（3）預變(bian)性條(tiao)件：對於(yu)壹(yi)些(xie)復雜模板(ban)，如(ru)菌液(ye)、菌落(luo)（尤(you)其(qi)是酵母(mu)）的PCR擴(kuo)增(zeng)，預(yu)變(bian)性時(shi)間(jian)可(ke)適(shi)當(dang)延長(chang)至(zhi)10分鐘，以(yi)提(ti)高(gao)預變(bian)性效果(guo)。

（4）目(mu)的片段長度：使用酵母(mu)菌液(ye)作(zuo)為(wei)PCR擴(kuo)增(zeng)模(mo)板(ban)時(shi)，建(jian)議目(mu)的片段長度不(bu)超(chao)過(guo)2.5 kb；若超(chao)出2.5 kb，建議(yi)將(jiang)酵母(mu)菌液(ye)預先進(jin)處理(li)。

百時(shi)美(mei)的 Taq DNA Polymerase為(wei)來源於嗜熱(re)菌Thermus aquaticus，經(jing)大腸(chang)桿菌重組表達(da)純化(hua)獲(huo)得的耐(nai)熱(re)性DNA聚(ju)合酶(mei)，分子(zi)量為(wei) 94 kDa，與(yu)天(tian)然Taq DNA 聚(ju)合酶(mei)具(ju)有(you)相同的功能。該酶(mei)具(ju)有(you) 5'→ 3' 聚(ju) 合酶(mei)活(huo)性和 5'→3' 外切酶(mei)活(huo)性，但無3'→ 5'外切酶(mei)活(huo)性。PCR 產(chan)物的3' 端帶(dai)有(you)突(tu)出的 A 堿基(ji)，可(ke)克(ke)隆至(zhi) T 載(zai)體。

總之，Taq DNA聚(ju)合酶(mei)在(zai)PCR技(ji)術(shu)中具有(you)重要(yao)作(zuo)用。通(tong)過了(le)解(jie)其(qi)特性、活(huo)性定義及(ji)質量(liang)控制(zhi)方法，合理(li)優(you)化(hua)PCR反應(ying)體系及(ji)程序(xu)，可(ke)以(yi)提(ti)高(gao)實(shi)驗結果(guo)的準(zhun)確(que)性和可(ke)靠性。在(zai)實(shi)際應(ying)用中，根(gen)據不(bu)同實(shi)驗需求(qiu)，對Taq DNA聚(ju)合酶(mei)進(jin)行優(you)化(hua)，有(you)助(zhu)於提(ti)高(gao)PCR技(ji)術(shu)的應用效果(guo)。

蘇州(zhou)阿爾法(fa)生(sheng)物作(zuo)為(wei)百時(shi)美生(sheng)物的聯盟(meng)供應(ying)商(shang)提(ti)供(gong)實(shi)驗室(shi)儀器設(she)備(bei)，實(shi)驗耗材，生(sheng)物試(shi)劑(ji)的壹(yi)站(zhan)式(shi)服(fu)務，所(suo)提(ti)供(gong)的分子(zi)生(sheng)物學試(shi)劑(ji)主要(yao)包括：限制(zhi)性內切酶(mei)AgeI、BamHI、BsaI、EcoRI和HindIII等80多種，taq聚(ju)合酶(mei)，逆(ni)轉(zhuan)試(shi)劑(ji)盒(he)，熒光定量試(shi)劑(ji)、體外轉(zhuan)錄酶(mei)等(deng)。