PCR實驗(yan)中常(chang)用(yong)的(de)限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)有(you)哪(na)些？

限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)是壹(yi)類(lei)能夠(gou)識別(bie)並切(qie)割(ge)雙鏈(lian)DNA上(shang)的(de)特定(ding)堿(jian)基序(xu)列的(de)蛋白(bai)質(zhi)。這些酶通常(chang)來(lai)源於細菌(jun)，它(ta)們的(de)名(ming)稱(cheng)往往(wang)與(yu)發(fa)現(xian)它(ta)們的(de)細菌(jun)種(zhong)類(lei)相關(guan)聯。AgeI、BamHI、BsaI、EcoRI和HindIII等(deng)限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)是分子(zi)生物(wu)學(xue)實驗(yan)室中(zhong)常(chang)用(yong)的(de)限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)，它(ta)們通過(guo)識別(bie)並切(qie)割(ge)特定(ding)的(de)DNA序(xu)列來(lai)發揮作(zuo)用(yong)。這些酶在(zai)基因克(ke)隆(long)、基因重(zhong)組、遺(yi)傳工(gong)程和(he)分(fen)子(zi)生物(wu)學(xue)研(yan)究中(zhong)扮演著(zhe)重要(yao)的(de)角色(se)。

壹(yi)、限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)的(de)作用(yong)機(ji)制

1. 識(shi)別(bie)DNA序(xu)列：限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)能夠(gou)識別(bie)DNA分子(zi)中的(de)特定(ding)序(xu)列，通常(chang)是幾個核苷(gan)酸長(chang)度的(de)序(xu)列。這些序(xu)列被(bei)稱(cheng)為限(xian)制性位點(dian)或(huo) recognition sequences（RS）。

2. 切(qie)割(ge)DNA：當(dang)限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)遇(yu)到(dao)與(yu)其(qi)RS匹配的(de)DNA序(xu)列時，它(ta)會(hui)沿(yan)著(zhe)該(gai)序(xu)列切(qie)割(ge)DNA，產生兩個平(ping)行的(de)片(pian)段。這種切(qie)割(ge)是(shi)特異(yi)性的(de)，即只發(fa)生在(zai)特定(ding)的(de)限(xian)制性位點(dian)上(shang)。

3. 釋(shi)放DNA片(pian)段：被(bei)切(qie)割(ge)的(de)DNA片(pian)段從(cong)分子(zi)上(shang)釋(shi)放出來(lai)，形成帶有(you)標(biao)記(ji)的(de)末端的(de)小片(pian)段。這些小片(pian)段可(ke)以(yi)通過(guo)進壹(yi)步(bu)的(de)實驗(yan)操作(zuo)進(jin)行純化(hua)和(he)分(fen)析(xi)。

二、在(zai)基因克(ke)隆(long)和(he)遺(yi)傳工(gong)程中(zhong)，限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)的(de)應用(yong)

1. 目(mu)的(de)基因的(de)分離：通過(guo)使(shi)用(yong)與(yu)目(mu)的(de)基因序(xu)列互補的(de)限(xian)制性位點(dian)來(lai)切(qie)割(ge)質(zhi)粒(li)DNA，從(cong)而(er)分離出目(mu)的(de)基因片(pian)段。

2. 重(zhong)組DNA分子(zi)的(de)構建(jian)：將目(mu)的(de)基因片(pian)段與(yu)載(zai)體(ti)DNA連接(jie)起來(lai)，使(shi)用(yong)限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)消化(hua)載(zai)體(ti)DNA，使(shi)其線(xian)性化(hua)，然(ran)後將目(mu)的(de)基因片(pian)段插入(ru)到載(zai)體(ti)中。

3. DNA片(pian)段的(de)鑒定(ding)和(he)大小分析(xi)：通過(guo)使(shi)用(yong)與(yu)限(xian)制性位點(dian)互補的(de)探針進行雜交(jiao)，可(ke)以(yi)鑒(jian)定(ding)DNA片(pian)段的(de)大小和是(shi)否(fou)存在(zai)。

4. 基因組文庫的(de)構建(jian)：通過(guo)切(qie)割(ge)整(zheng)個基因組DNA，產生壹(yi)系(xi)列帶有(you)不(bu)同限(xian)制性位點(dian)的(de)片(pian)段，然(ran)後將這些片(pian)段克(ke)隆(long)到(dao)載(zai)體(ti)上(shang)，構建(jian)基因組文庫。

PCR（聚(ju)合(he)酶(mei)鏈(lian)反應）是壹(yi)種(zhong)常用(yong)的(de)分子(zi)生物(wu)學(xue)技術(shu)，它(ta)能夠(gou)以指數級(ji)擴增(zeng)DNA片(pian)段。PCR的(de)基本(ben)原(yuan)理(li)是(shi)利用(yong)DNA聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)活(huo)性，在(zai)引(yin)物(wu)（短的(de)單鏈DNA片(pian)段）的(de)存在(zai)下，合(he)成新(xin)的(de)DNA鏈。

三、PCR反應過程

1. 模(mo)板DNA的(de)準備：選擇壹(yi)段(duan)含有(you)目(mu)的(de)基因的(de)DNA片(pian)段作(zuo)為(wei)模(mo)板。

2. 引(yin)物(wu)的(de)設計：設(she)計兩(liang)段引(yin)物(wu)，這兩段引(yin)物(wu)與(yu)模(mo)板DNA上(shang)的(de)目(mu)的(de)基因序(xu)列互補。

3. PCR反應混合物(wu)的(de)制備(bei)：將模(mo)板DNA、引(yin)物(wu)、四(si)種(zhong)脫(tuo)氧核(he)苷(gan)酸（dATP、dCTP、dGTP和(he)dTTP）、DNA聚(ju)合(he)酶(mei)和(he)其他必要的(de)試(shi)劑混(hun)合(he)在(zai)壹(yi)起。

4. PCR循(xun)環：PCR反應在(zai)熱循(xun)環儀(yi)中(zhong)進(jin)行，包括(kuo)變(bian)性、復(fu)性和延(yan)伸(shen)三(san)個階段。變性階段，模(mo)板DNA被(bei)加(jia)熱至90°C左(zuo)右，使(shi)DNA雙鏈(lian)分(fen)開；復(fu)性階段，溫度(du)下(xia)降(jiang)，引(yin)物(wu)與(yu)模(mo)板DNA互補配對；延(yan)伸(shen)階段，溫度(du)再(zai)次升(sheng)高(gao)，DNA聚(ju)合(he)酶(mei)沿(yan)著(zhe)引(yin)物(wu)合(he)成(cheng)新鏈。

5. 產物(wu)的(de)檢(jian)測(ce)：PCR產物(wu)可(ke)以(yi)通過(guo)多種方法(fa)進行檢(jian)測(ce)，如電泳、 Southern blotting、 Northern blotting、實(shi)時熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR等。

         在(zai)實際應用(yong)中(zhong)，AgeI、BamHI、BsaI、EcoRI和(he)HindIII等(deng)限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)通常(chang)與(yu)PCR技(ji)術相(xiang)結合，用(yong)於(yu)目(mu)的(de)基因的(de)克(ke)隆(long)和(he)表達、基因組文庫的(de)構建(jian)、基因突(tu)變(bian)的(de)研(yan)究以(yi)及(ji)病原(yuan)體(ti)檢(jian)測(ce)等領(ling)域(yu)。例如，在(zai)目(mu)的(de)基因克(ke)隆(long)中(zhong)，先用(yong)限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)切(qie)割(ge)質(zhi)粒(li)DNA，得(de)到帶有(you)目(mu)的(de)基因片(pian)段的(de)線性化(hua)DNA，然(ran)後將其與(yu)PCR擴(kuo)增(zeng)的(de)目(mu)的(de)基因片(pian)段連接(jie)起來(lai)，再(zai)通過(guo)PCR擴增(zeng)來(lai)檢(jian)測(ce)連接(jie)是(shi)否(fou)成功(gong)。在(zai)基因組文庫構建(jian)中，先用(yong)限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)切(qie)割(ge)全(quan)基因組DNA，得(de)到壹(yi)系(xi)列DNA片(pian)段，然(ran)後將這些片(pian)段克(ke)隆(long)到(dao)載(zai)體(ti)上(shang)，構建(jian)基因組文庫。在(zai)基因突(tu)變(bian)研(yan)究中(zhong)，可(ke)以(yi)使(shi)用(yong)限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)來(lai)檢(jian)測(ce)DNA序(xu)列的(de)變化(hua)。在(zai)病原(yuan)體(ti)檢(jian)測(ce)中，可(ke)以(yi)將限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)與(yu)PCR結合，用(yong)來(lai)檢(jian)測(ce)病原(yuan)體(ti)的(de)存在(zai)。

     總之(zhi)，限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)和PCR技術的(de)結合為分子(zi)生物(wu)學(xue)研(yan)究提(ti)供(gong)了強大的(de)工(gong)具，使(shi)得(de)目(mu)的(de)基因的(de)克(ke)隆(long)、基因組的(de)分析(xi)和(he)病原(yuan)體(ti)檢(jian)測(ce)相對容(rong)易(yi)。 蘇州(zhou)阿(e)爾法(fa)生物(wu)作(zuo)為(wei)百時美(mei)的(de)聯盟供應(ying)商(shang)提(ti)供(gong)實驗(yan)室儀(yi)器設(she)備(bei)，實(shi)驗(yan)耗(hao)材(cai)，生物(wu)試(shi)劑的(de)壹(yi)站式(shi)服(fu)務(wu)，所提(ti)供(gong)的(de)分子(zi)生物(wu)學(xue)試(shi)劑主(zhu)要包括(kuo)：限(xian)制性內(nei)切(qie)酶(mei)AgeI、BamHI、BsaI、EcoRI和HindIII等80多種，taq聚(ju)合(he)酶(mei)，逆轉試(shi)劑盒(he)，熒(ying)光(guang)定(ding)量試(shi)劑、體(ti)外(wai)轉(zhuan)錄酶等。