PCR儀(yi)進行PCR反(fan)應時(shi)產生(sheng)引物二聚(ju)體(ti)該(gai)怎(zen)麽辦(ban)？

在(zai)分(fen)子生(sheng)物學(xue)領(ling)域(yu)，PCR技(ji)術是壹種重(zhong)要(yao)的科研手(shou)段(duan)，它能夠(gou)快(kuai)速、高效地擴增(zeng)特定(ding)的 DNA 片(pian)段(duan)。然(ran)而，在(zai)使(shi)用(yong)PCR儀(yi)進行PCR反(fan)應的(de)過(guo)程(cheng)中，有時會(hui)出(chu)現壹種非(fei)預(yu)期現象 ——引物二聚(ju)體(ti)的(de)形(xing)成(cheng)。本(ben)文(wen)將(jiang)帶(dai)您(nin)深(shen)入了解引物二聚(ju)體(ti)的(de)成(cheng)因(yin)、影(ying)響及其(qi)在(zai) PCR反(fan)應中(zhong)的(de)應(ying)對策略(lve)。

壹、PCR反(fan)應的(de)基(ji)本原理(li)

在(zai)探(tan)討(tao)引物二聚(ju)體(ti)之(zhi)前，我們先(xian)簡要(yao)回顧(gu)壹下(xia)PCR反(fan)應的(de)基(ji)本原理(li)。PCR包括(kuo)三(san)個主(zhu)要(yao)步驟(zhou)：變性（Denaturation）、退(tui)火（Annealing）和延(yan)伸（Extension）。

• 變性：在(zai)高(gao)溫（通常為(wei)94-98℃）下，雙鏈DNA解(jie)鏈(lian)成(cheng)單(dan)鏈。

• 退(tui)火：溫度降低(di)（通常為(wei)50-65℃），引物與單(dan)鏈DNA模板特異(yi)性結(jie)合(he)。

• 延(yan)伸：在(zai)適(shi)宜的酶(mei)和(he)底(di)物條件(jian)下，DNA聚(ju)合(he)酶(mei)從引物開始(shi)，沿(yan)著(zhe)模(mo)板(ban)鏈(lian)合成(cheng)新的DNA鏈(lian)。

通過(guo)這三(san)個步驟(zhou)的(de)循(xun)環(huan)，目(mu)標DNA片(pian)段(duan)得以指數(shu)級擴增(zeng)。

二、引物二聚(ju)體(ti)的(de)成(cheng)因(yin) 

引物二聚(ju)體(ti)是在(zai)PCR反(fan)應的(de)退(tui)火步驟(zhou)中(zhong)形(xing)成(cheng)的(de)，主(zhu)要(yao)原因(yin)如(ru)下(xia)：

• 引物自身互(hu)補：如果(guo)引物的序列(lie)存在(zai)互(hu)補(bu)區(qu)域(yu)，它們可(ke)能會(hui)在(zai)退(tui)火過(guo)程(cheng)中相互結合，形(xing)成(cheng)引物二聚(ju)體(ti)。

• 引物濃度：當引物濃度過(guo)高(gao)時，引物分(fen)子之(zhi)間的(de)碰(peng)撞幾(ji)率(lv)增(zeng)加(jia)，容(rong)易(yi)形(xing)成(cheng)二(er)聚(ju)體(ti)。

• 退(tui)火溫度：退(tui)火溫度過(guo)低(di)，使(shi)得引物之(zhi)間的(de)互(hu)補結合(he)更容(rong)易(yi)發(fa)生(sheng)；退(tui)火溫度過(guo)高(gao)，則可(ke)能導(dao)致(zhi)引物與模(mo)板的結合(he)效(xiao)率(lv)降低(di)，剩余的(de)引物更容(rong)易(yi)形(xing)成(cheng)二(er)聚(ju)體(ti)。

• 反(fan)應體(ti)系(xi)：PCR反(fan)應體(ti)系(xi)中(zhong)的離(li)子強(qiang)度、pH值等因(yin)素(su)也會(hui)影(ying)響引物二聚(ju)體(ti)的(de)形(xing)成(cheng)。

三(san)、引物二聚(ju)體(ti)的(de)影(ying)響

引物二聚(ju)體(ti)的(de)形(xing)成(cheng)對PCR反(fan)應有以下幾(ji)點(dian)影(ying)響：

•  降低(di)擴增(zeng)效率(lv)：引物二聚(ju)體(ti)消耗(hao)了部分(fen)引物，導(dao)致(zhi)目標DNA片(pian)段(duan)的(de)擴增(zeng)效率(lv)降低(di)。

• 影(ying)響結(jie)果(guo)判(pan)斷(duan)：在(zai)瓊(qiong)脂糖(tang)凝(ning)膠(jiao)電泳(yong)中，引物二聚(ju)體(ti)可(ke)能會(hui)形(xing)成(cheng)低(di)於(yu)目標條帶(dai)的條帶(dai)，幹擾實(shi)驗結(jie)果(guo)的(de)判(pan)斷。

• 影(ying)響後(hou)續實(shi)驗：如(ru)果(guo)引物二聚(ju)體(ti)在(zai)PCR產物中含量較高(gao)，可(ke)能會(hui)影(ying)響後(hou)續實(shi)驗，如(ru)基(ji)因(yin)克隆、測(ce)序等。

四(si)、應對引物二聚(ju)體(ti)的(de)策略(lve)

為了避免(mian)或(huo)減(jian)少引物二聚(ju)體(ti)的(de)形(xing)成(cheng)，可(ke)以采取以下措施(shi)：

1. 優(you)化引物設(she)計(ji)：在(zai)設(she)計(ji)引物時，盡(jin)量避免(mian)引物之(zhi)間存在(zai)互(hu)補(bu)序(xu)列，降低(di)引物二聚(ju)體(ti)形(xing)成(cheng)的(de)可(ke)能性。

2. 調(tiao)整(zheng)引物濃度：適(shi)當降低(di)引物濃度，減(jian)少引物之(zhi)間的(de)碰(peng)撞幾(ji)率(lv)。

3. 優化退(tui)火溫度：通過(guo)梯(ti)度PCR確定最佳退(tui)火溫度，使(shi)引物與模(mo)板的結合(he)效(xiao)率(lv)MAX。

4. 改(gai)進反(fan)應體(ti)系(xi)：調(tiao)整反(fan)應體(ti)系(xi)中(zhong)的離(li)子強(qiang)度、pH值等參數，以減少引物二聚(ju)體(ti)的(de)形(xing)成(cheng)。

5. 使(shi)用(yong)親(qin)和層析(xi)柱：在(zai)PCR產物純化過(guo)程(cheng)中，使(shi)用(yong)親(qin)和層析(xi)柱可(ke)以有效去除(chu)引物二聚(ju)體(ti)。

朗基(ji)T10C觸屏(ping)梯(ti)度PCR儀(yi)為在(zai)應(ying)對引物二聚(ju)體(ti)問(wen)題上存在(zai)著(zhe)以下幾(ji)個關(guan)鍵優勢：

快(kuai)速升(sheng)溫速率(lv)：朗基(ji)T10C采用(yong)的半(ban)導(dao)體(ti)芯(xin)片(pian)技(ji)術使(shi)升(sheng)溫速率(lv)達(da)到9℃/秒，這意(yi)味(wei)著(zhe)PCR反(fan)應可(ke)以迅速通過(guo)變性步(bu)驟(zhou)，減(jian)少引物在(zai)高(gao)溫下的非(fei)特異(yi)性結(jie)合(he)，從而降低(di)引物二聚(ju)體(ti)的(de)形(xing)成(cheng)。

1. 精(jing)確的(de)梯(ti)度技(ji)術：二維(wei)梯(ti)度技(ji)術允許(xu)用(yong)戶在(zai)同(tong)壹塊PCR板上設(she)置(zhi)不(bu)同的(de)退(tui)火溫度，這有助於(yu)找(zhao)到合適(shi)的退(tui)火溫度，從而減少引物與引物之(zhi)間的(de)非(fei)特異(yi)性結(jie)合(he)，而更多(duo)地與模(mo)板DNA特異(yi)性結(jie)合(he)。

2. 高(gao)循(xun)環(huan)壽(shou)命(ming)：循(xun)環(huan)壽(shou)命(ming)高(gao)達(da)100萬(wan)次(ci)，保(bao)證了儀(yi)器在(zai)長(chang)時(shi)間使(shi)用(yong)下的(de)穩定性，減(jian)少了由(you)於(yu)儀(yi)器性能下(xia)降導(dao)致(zhi)的引物二聚(ju)體(ti)問(wen)題。

3. 96孔全(quan)裙邊(bian)板材(cai)設(she)計(ji)：這種設(she)計(ji)有助於(yu)均勻加(jia)熱每(mei)個孔，減少了孔與孔之(zhi)間的(de)溫度差異(yi)，從而減少了因(yin)溫度不均導(dao)致(zhi)的引物二聚(ju)體(ti)形(xing)成(cheng)。

4. 智(zhi)能控(kong)屏(ping)：用(yong)戶友(you)好的(de)觸屏(ping)操(cao)作界面使(shi)得設(she)置(zhi)和(he)調整(zheng)反(fan)應參數變得簡單(dan)快(kuai)捷，有助於(yu)優化反(fan)應條(tiao)件(jian)，減少引物二聚(ju)體(ti)的(de)形(xing)成(cheng)。

5. 兼(jian)容性和(he)多(duo)功(gong)能性：適(shi)用(yong)於(yu)0.2ml或(huo)0.1ml PCR管(guan)及8聯管(guan)，提(ti)供了靈活的(de)實(shi)驗設(she)計(ji)選(xuan)項，同(tong)時(shi)，儀(yi)器具(ju)備升(sheng)級為(wei)熒光定量PCR儀(yi)的功(gong)能，為(wei)後(hou)續的(de)定(ding)量分(fen)析(xi)提(ti)供了便(bian)利(li)，也減(jian)少了在(zai)定(ding)量PCR中引物二聚(ju)體(ti)可(ke)能帶(dai)來的幹(gan)擾(rao)。

綜上所述(shu)，引物二聚(ju)體(ti)是PCR反(fan)應中(zhong)的(de)壹種常見現象，但(dan)它對實(shi)驗結(jie)果(guo)的(de)影(ying)響不(bu)容(rong)忽(hu)視。通過(guo)深(shen)入了解其(qi)成(cheng)因(yin)、影(ying)響及應對策略(lve)，我們可(ke)以在(zai)實(shi)際操(cao)作中盡(jin)量避免(mian)或(huo)減(jian)少引物二聚(ju)體(ti)的(de)形(xing)成(cheng)，從而提(ti)高PCR反(fan)應的(de)準(zhun)確性和(he)可(ke)靠性。

另(ling)外，我們也了解到朗基(ji)T10C觸屏(ping)梯(ti)度PCR儀(yi)通過(guo)其(qi)快(kuai)速升(sheng)溫、精確梯(ti)度控制(zhi)、高穩定性、均勻加(jia)熱和智(zhi)能化操作等優(you)勢(shi)，有效減少了引物二聚(ju)體(ti)的(de)形(xing)成(cheng)，提(ti)高了PCR反(fan)應的(de)特(te)異(yi)性和(he)效(xiao)率(lv)，為科研工(gong)作者提(ti)供了可(ke)靠的(de)實(shi)驗結(jie)果(guo)。更多(duo)PCR儀(yi)器相關(guan)問(wen)題請進入蘇州(zhou)阿(e)爾(er)法(fa)生(sheng)物網站(zhan)進行了解。