熒光(guang)定(ding)量PCR原理(li)和(he)應(ying)用

熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction，簡(jian)稱qPCR）是(shi)壹(yi)種(zhong)用(yong)於(yu)檢(jian)測和(he)定量DNA或(huo)RNA的方法。它(ta)利用(yong)熒光(guang)標(biao)記(ji)的探針或(huo)染料，通過實時(shi)監測PCR反(fan)應過程(cheng)中熒光(guang)信號的變化，實現對(dui)目標(biao)核(he)酸(suan)的定量分析(xi)。本(ben)文(wen)將詳細(xi)介(jie)紹(shao)熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR的原理(li)、操(cao)作(zuo)技術(shu)及其(qi)在(zai)科(ke)研(yan)和應(ying)用。

壹(yi)、熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR原理(li)

1. PCR原理(li)

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈(lian)反應）是壹(yi)種(zhong)在(zai)體外(wai)模(mo)擬DNA復(fu)制(zhi)過程(cheng)的技術(shu)。通(tong)過設計(ji)特(te)異(yi)性(xing)引(yin)物(wu)，PCR可(ke)以擴增(zeng)目標(biao)DNA片段，使(shi)其在(zai)短(duan)時(shi)間內(nei)達到可(ke)檢測的水平。PCR主要包括三(san)個階段：變(bian)性(xing)、退(tui)火和延伸。

2. 熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR原理(li)

熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR在(zai)傳統(tong)PCR基礎上，引(yin)入(ru)了(le)熒光(guang)標(biao)記(ji)技術(shu)。根(gen)據(ju)熒(ying)光(guang)標(biao)記(ji)物(wu)的不同(tong)，熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR可(ke)分為兩(liang)種(zhong)：染料法和(he)探針法。

（1）染料法

染料法利(li)用壹(yi)種(zhong)能與雙(shuang)鏈DNA特(te)異(yi)性(xing)結(jie)合的熒光(guang)染料，如SYBR Green I。在PCR反應體系(xi)中，染料與雙(shuang)鏈DNA結(jie)合後，熒光(guang)信號增強(qiang)。隨(sui)著PCR反應的進行(xing)，擴增(zeng)產物(wu)不斷積(ji)累(lei)，熒光(guang)信號也隨(sui)之(zhi)增強(qiang)。通過實時(shi)監測熒(ying)光(guang)信號的變化，可(ke)以計(ji)算(suan)出(chu)目(mu)標(biao)DNA的初始(shi)濃(nong)度(du)。

（2）探針法

探針法采(cai)用(yong)壹(yi)種(zhong)特(te)異(yi)性(xing)熒(ying)光(guang)標(biao)記(ji)的探針，如(ru)TaqMan探針。探針的5’端標(biao)記報告(gao)熒(ying)光(guang)基團(tuan)，3’端標記(ji)淬(cui)滅熒光(guang)基團(tuan)。在探針完(wan)整時(shi)，報告(gao)熒(ying)光(guang)基團(tuan)的熒光(guang)信號被淬(cui)滅基團(tuan)抑制(zhi)。當(dang)PCR反應(ying)進行(xing)到退火(huo)階段，探針與目(mu)標DNA特(te)異(yi)性(xing)結(jie)合，Taq酶的5’→3’外切(qie)酶活(huo)性(xing)將探針切(qie)斷，使(shi)報告(gao)熒(ying)光(guang)基團(tuan)與淬(cui)滅熒光(guang)基團(tuan)分離，熒(ying)光(guang)信號得以(yi)釋(shi)放(fang)。通(tong)過實時(shi)監測熒(ying)光(guang)信號的變化，可(ke)以實現對(dui)目標(biao)DNA的定量。

二(er)、熒光(guang)定(ding)量PCR操(cao)作技術(shu)

1. 實驗前(qian)準備(bei)

（1）試(shi)劑(ji)與儀(yi)器：主要包括熒光(guang)定(ding)量PCR試(shi)劑(ji)盒(he)、熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR儀(yi)、離心(xin)機、移(yi)液(ye)器等(deng)。

（2）樣(yang)本(ben)處理(li)：提(ti)取(qu)目標DNA或(huo)RNA，確(que)保(bao)純(chun)度(du)和濃(nong)度(du)達到實驗要求。

（3）引(yin)物(wu)和探針設計(ji)：根(gen)據(ju)目(mu)標(biao)基因(yin)序列，設計(ji)特(te)異(yi)性(xing)引(yin)物(wu)和探針。

2. 實驗步(bu)驟

（1）配制反(fan)應(ying)體系(xi)：根(gen)據(ju)試(shi)劑(ji)盒(he)說(shuo)明(ming)書，將PCR反應(ying)所需試(shi)劑(ji)混合，包(bao)括引(yin)物(wu)、探針、DNA模(mo)板(ban)、dNTPs、Taq酶等(deng)。

（2）PCR擴增(zeng)：將反應(ying)體系(xi)放(fang)入(ru)熒光(guang)定(ding)量PCR儀(yi)，按照以下程(cheng)序(xu)進行擴增(zeng)：

• 變性(xing)：95℃，30秒(miao)

• 退火(huo)：55-65℃，30秒(miao)

• 延伸：72℃，30秒(miao)

壹(yi)般(ban)為40個循(xun)環(huan)，每個(ge)循(xun)環(huan)結(jie)束後收(shou)集(ji)熒光(guang)信號。

（3）數據(ju)分析(xi)：根(gen)據(ju)熒(ying)光(guang)信號的變化，繪(hui)制擴增(zeng)曲線(xian)和熔解(jie)曲線(xian)。通過分析(xi)擴增(zeng)曲線(xian)，可(ke)以得(de)到目標(biao)DNA的初始(shi)濃(nong)度(du)；熔(rong)解(jie)曲線(xian)可(ke)以判斷擴增(zeng)產物(wu)是否(fou)特(te)異(yi)性(xing)。

三(san)、熒光(guang)定(ding)量PCR應(ying)用

1. 科(ke)研(yan)領域(yu)：熒光(guang)定(ding)量PCR廣(guang)泛應(ying)用(yong)於(yu)基因(yin)表達分析(xi)、基因(yin)突(tu)變檢(jian)測、微(wei)生物檢(jian)測等(deng)領域(yu)。

2. 臨床診斷：熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR在(zai)病(bing)原體檢(jian)測、腫(zhong)瘤基因(yin)診斷、遺傳病(bing)篩(shai)查(zha)等(deng)方面(mian)具(ju)有重(zhong)要應用(yong)價值(zhi)。

3. 食(shi)品(pin)安(an)全：用(yong)於(yu)檢(jian)測食(shi)品中的微生物、轉(zhuan)基因(yin)成分等(deng)。

4. 環(huan)境(jing)監測：用(yong)於(yu)檢(jian)測環(huan)境(jing)樣(yang)品(pin)中的微生物、病(bing)原體等(deng)。

總之，熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR作(zuo)為壹(yi)種(zhong)高(gao)效、準確(que)的核(he)酸(suan)檢(jian)測方(fang)法，為科(ke)研(yan)，生物檢(jian)測等(deng)領域(yu)提(ti)供(gong)了(le)有力(li)手(shou)段。隨(sui)著技術(shu)的不斷發展，熒光(guang)定(ding)量PCR有(you)望在(zai)更多領(ling)域(yu)發揮重要作用(yong)。

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