神(shen)經(jing)元(yuan)-神(shen)經(jing)膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)和(he)免疫細胞(bao)的(de)細胞共(gong)培養步(bu)驟

神(shen)經(jing)元(yuan)-神(shen)經(jing)膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)和(he)免疫細胞(bao)的(de)細胞共(gong)培養步(bu)驟如(ru)下(xia)：

1將hPSC分(fen)化(hua)為星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)

1.按(an)照STEMdiff™星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)和(he)成熟(shu)試(shi)劑(ji)盒使(shi)用(yong)說明(ming)中(zhong)概述的胚(pei)狀(zhuang)體（EB）或單層(ceng)方(fang)案(an)進行(xing)操作。

2.星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)成熟(shu)階(jie)段：星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)在(zai)STEMdiff™星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)成熟(shu)培(pei)養基(ji)中培(pei)養至(zhi)少3周(zhou)。

3.通(tong)過(guo)對(dui)培(pei)養的細(xi)胞亞(ya)群(qun)進行(xing)免疫細胞(bao)化(hua)學(xue)分析來驗證(zheng)星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)是(shi)否(fou)成功(gong)。按(an)照STEMdiff™星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)試(shi)劑(ji)盒使(shi)用(yong)說明(ming)，細(xi)胞(bao)群(qun)應大於(yu)70% S100ꞵ+、大(da)於60% GFAP+和低(di)於15% ꞵIII-tubulin或雙皮(pi)質素（DCX）陽性(xing)。

2 將hPSC分(fen)化(hua)為小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)

1.按(an)照STEMdiff™造血試(shi)劑(ji)盒使(shi)用(yong)說明(ming)中(zhong)概述的方(fang)案(an)生(sheng)成造(zao)血(xue)祖(zu)細胞(bao)（HPC）。

2.過(guo)流式細胞術(shu)評估(gu)HPC分化(hua)效(xiao)率。所(suo)得(de)細胞(bao)群應大於(yu)90% CD43+ 和(he)大於20% CD34/CD45共(gong)陽性(xing)。

3.按照(zhao)STEMdiff™小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)和(he)成熟(shu)試(shi)劑(ji)盒使(shi)用(yong)說明(ming)的(de)A部(bu)分(fen)（小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)）中(zhong)概述的步(bu)驟(zhou)1-8進行(xing)操作。

4.通(tong)過(guo)流式細胞術(shu)評估(gu)小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)的(de)效(xiao)率。所(suo)得(de)細胞(bao)群應超(chao)過(guo)80%為CD45和CD11b共(gong)陽性(xing)。

5.可(ke)選(xuan)步(bu)驟(zhou)：在(zai)第五(wu)部(bu)分的共(gong)培(pei)養之前(qian)，可(ke)以(yi)使(shi)用(yong)STEMdiff™小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)成熟(shu)試(shi)劑(ji)盒進壹(yi)步培養(yang)小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)，但小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)後的(de)額(e)外培(pei)養(yang)總(zong)時間(jian)不(bu)得(de)超(chao)過(guo)10天(tian)（成熟(shu)期和(he)共培(pei)養(yang)期的(de)總和(he)）。

3將hPSC分(fen)化(hua)為前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)

1.根據(ju)STEMdiff™前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)分(fen)化(hua)和(he)成熟(shu)試(shi)劑(ji)盒使(shi)用(yong)說明(ming)中(zhong)概述的胚(pei)狀(zhuang)體（EB）或單層(ceng)方(fang)案(an)進行(xing)操作。

註：將神(shen)經(jing)元(yuan)前(qian)體細(xi)胞(bao)接種到STEMdiff™前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)成熟(shu)培(pei)養基(ji)中（使(shi)用(yong)說明(ming)C部(bu)分(fen)第(di)1步）時，星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)和(he)小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)共(gong)培養的建議(yi)密(mi)度範(fan)圍為1.5 x 104 - 4 x 104細胞(bao)/cm2。最(zui)佳(jia)密(mi)度根據(ju)實際情況(kuang)相應調(tiao)整。

2.前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)成熟(shu)階(jie)段：神(shen)經(jing)元(yuan)在(zai)STEMdiff™前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)成熟(shu)培(pei)養基(ji)中培(pei)養至(zhi)少7天(tian)。

3.通(tong)過(guo)對(dui)培(pei)養的細(xi)胞亞(ya)群(qun)進行(xing)免疫細胞(bao)化(hua)學(xue)分析來驗證(zheng)前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)分(fen)化(hua)是(shi)否(fou)成功(gong)。所(suo)得細胞群(qun)ꞵIII-tubulin和(he)FOXG1的(de)陽性(xing)率應大於(yu)90%，星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)標誌(zhi)物(wu)GFAP的(de)陽性(xing)率應低於(yu)10%。

4建立(li)前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)-星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)共(gong)培養

1.按照(zhao)STEMdiff™星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)試(shi)劑(ji)盒的(de)使(shi)用(yong)說明(ming)的(de)C部(bu)分(fen)（星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)成熟(shu)）的(de)步驟(zhou)1-5從第壹(yi)部分中(zhong)分(fen)離(li)成熟(shu)的(de)星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)。

註：將細(xi)胞(bao)重新懸(xuan)浮(fu)在(zai)1 mL STEMdiff™星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)成熟(shu)培(pei)養基(ji)中，然後使(shi)用(yong)臺(tai)盼(pan)藍(lan)和(he)血(xue)細(xi)胞計(ji)數器(qi)進行(xing)細胞計(ji)數。

2.在(zai)STEMdiff™星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)成熟(shu)培(pei)養基(ji)中稀釋細(xi)胞(bao)懸(xuan)浮(fu)液(ye)，以(yi)獲(huo)得(de)所(suo)需(xu)的細胞濃度(du)和(he)體積(ji)。

註：星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)懸(xuan)浮(fu)液(ye)的(de)濃(nong)度(du)和(he)體積(ji)應自(zi)行(xing)優化(hua)，並(bing)取決於(yu)所(suo)需的星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)與(yu)神(shen)經(jing)元(yuan)的(de)細胞類(lei)型(xing)比率、使(shi)用(yong)的培(pei)養孔數(shu)量以(yi)及第(di)三部(bu)分第1步(bu)中(zhong)接種的前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)前(qian)體的(de)初始(shi)細(xi)胞密(mi)度。推(tui)薦(jian)進行(xing)共培養時(shi)星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)與(yu)前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)的(de)比率為1:1。

3.取出(chu)並棄(qi)去(qu)第(di)三(san)部分(fen)中前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)生(sheng)成的(de)培(pei)養基(ji)。

4.將步(bu)驟(zhou)2中制(zhi)備的懸(xuan)浮(fu)星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)接種到前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)上(shang)，並在(zai)STEMdiff™星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)成熟(shu)培(pei)養基(ji)中培(pei)養過(guo)夜(ye)。繼(ji)續第五(wu)部(bu)分。

5建立(li)共(gong)培養(yang)體系(xi)

1.在BrainPhys™的(de)使(shi)用(yong)說明(ming)中(zhong)，按(an)照(zhao)“分化(hua)培(pei)養基(ji)的制(zhi)備"（B部(bu)分）的說明(ming)制(zhi)備(bei)所(suo)需體積(ji)的BrainPhys™神(shen)經(jing)元(yuan)培(pei)養基(ji)和添加(jia)物(wu)。

註：所需培養(yang)基(ji)的量(liang)取決(jue)於培養板(ban)的(de)形式和(he)所(suo)需的共(gong)培養(yang)的(de)周(zhou)期。

2.將STEMdiff™小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)添加(jia)物(wu)2在(zai)室(shi)溫(wen)下解(jie)凍或者在(zai)2-8°C下(xia)過(guo)夜(ye)。充(chong)分混(hun)合。

註：如(ru)果(guo)不立(li)即(ji)使(shi)用(yong)，請分裝並儲存(cun)在(zai)-20°C下(xia)。請勿超(chao)過(guo)標簽上(shang)標明(ming)的(de)有(you)效(xiao)期 (EXP)。另(ling)外，該(gai)組(zu)分可(ke)單獨購(gou)買。

3.按照以(yi)下步(bu)驟制(zhi)備優化(hua)的(de)共培養(yang)基(ji)：

a. 將STEMdiff™小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)添加(jia)物(wu)2添加(jia)到(dao)BrainPhys™神(shen)經(jing)元(yuan)培(pei)養基(ji)和添加(jia)物(wu)中(zhong)，直(zhi)至(zhi)最(zui)終(zhong)濃(nong)度(du)為1X（如(ru)每(mei)10 mL培養基(ji)添加(jia)40 µL添加(jia)物(wu)）。

b. 充(chong)分混(hun)合。

註：如(ru)果(guo)不立(li)即(ji)使(shi)用(yong)，培養(yang)基(ji)存(cun)放在(zai)2-8°C下(xia)最(zui)多2周(zhou)。

4.從第(di)二(er)部分(fen)收集(ji)小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)：

a. 將整(zheng)個(ge)細胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)轉(zhuan)移到15 mL離(li)心管中(zhong)。為收集(ji)盡(jin)可(ke)能多(duo)的(de)細胞(bao)，可(ke)以(yi)使(shi)用(yong)含有(you)15 mM HEPES的(de)溫(wen)熱(re)DMEM/F-12進行(xing)清洗。

b . 以(yi) 300 x g轉(zhuan)速離(li)心5分鐘。

c . 去除上(shang)清液(ye)，並將沈(chen)澱(dian)物(wu)重(zhong)新懸(xuan)浮(fu)在(zai)適(shi)當體(ti)積(ji)的共培養(yang)基(ji)中。

d . 使(shi)用(yong)臺(tai)盼(pan)藍(lan)和(he)血(xue)細(xi)胞計(ji)數器(qi)計(ji)數細(xi)胞。

5.在新的共培(pei)養基(ji)中稀釋小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)懸(xuan)浮(fu)液(ye)，以(yi)獲(huo)得(de)所(suo)需(xu)的最(zui)終(zhong)細(xi)胞(bao)濃度(du)和體(ti)積(ji)。

6.取出並丟(diu)棄(qi)第四(si)部(bu)分(fen)中(zhong)產(chan)生(sheng)的(de)前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan) - 星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)共(gong)培養物(wu)的(de)培養(yang)基(ji)。

7.將重(zhong)新懸(xuan)浮(fu)的(de)小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)接種到共培(pei)養(yang)的前(qian)腦(nao)神(shen)經(jing)元(yuan)和(he)星(xing)形膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)上(shang)。

8.將培(pei)養(yang)板放入(ru)37°C、5% CO2培(pei)養(yang)箱中(zhong)。通(tong)過(guo)快(kuai)速(su)、短暫地(di)前(qian)後和(he)左右移動培(pei)養板(ban)，使(shi)細(xi)胞(bao)分(fen)布均勻。

9.每(mei)2-3天使(shi)用(yong)共培(pei)養基(ji)進行(xing)半換液。

註：小膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)是(shi)半粘附(fu)的(de)，在(zai)更換(huan)培養基(ji)時可(ke)能會被移除。在進行(xing)半換液之前(qian)，將板(ban)放入(ru)帶(dai)有(you)板(ban)適(shi)配(pei)器(qi)的吊桶(tong)式(shi)離心機中(zhong)，以(yi)100 x g的速(su)度離(li)心2分鐘(zhong)，使(shi)細(xi)胞(bao)沈(chen)降。

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