使用熒光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀(yi)時如何優化qPCR實(shi)驗(yan)操作和數據分析

實時熒光(guang)定(ding)量(liang)PCR（qPCR）技(ji)術(shu)作為(wei)分子(zi)生(sheng)物(wu)學(xue)領(ling)域(yu)中重(zhong)要(yao)的實(shi)驗(yan)室(shi)儀器(qi)，已(yi)廣泛(fan)應(ying)用於(yu)各類(lei)生(sheng)物(wu)學(xue)研(yan)究。然(ran)而，由(you)於操作不當(dang)，許多(duo)研(yan)究人(ren)員(yuan)在(zai)實(shi)驗(yan)中遇到了(le)數據精(jing)度(du)不(bu)高、重(zhong)復性(xing)差、可(ke)信度(du)差(cha)等(deng)問(wen)題。本文針對這些問(wen)題，從(cong)引(yin)物(wu)操作技巧(qiao)、反應(ying)體(ti)系配(pei)制技巧(qiao)、陰性(xing)對照(zhao)技巧(qiao)以及(ji)結果(guo)分析技巧(qiao)四(si)個方(fang)面(mian)，詳(xiang)細介紹了(le)使(shi)用熒光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀(yi)時如何優化qPCR實(shi)驗(yan)操作和數據分析，以提高(gao)實(shi)驗(yan)結果(guo)的準確(que)性(xing)和可(ke)靠性(xing)。

壹、引(yin)物(wu)的操作技巧(qiao)

使用熒光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀(yi)在(zai)進(jin)行qPCR實驗(yan)時，引(yin)物(wu)的設(she)計至關重(zhong)要(yao)。使(shi)用引(yin)物(wu)設(she)計軟(ruan)件(jian)進(jin)行設(she)計時，需(xu)在(zai)操作界面(mian)上(shang)設(she)定(ding)相(xiang)應的參數，擴增子(zi)參數壹般(ban)設(she)定(ding)範圍為(wei)80～200bp。擴增子(zi)長(chang)度(du)越(yue)短(duan)，擴增效率(lv)越(yue)高，可(ke)選(xuan)擇(ze)設(she)定(ding)在(zai)110bp。引(yin)物(wu)壹般(ban)由試(shi)劑(ji)公司合成(cheng)，為(wei)幹粉(fen)狀態(tai)，在(zai)溶(rong)解(jie)前，最(zui)好(hao)用高(gao)速離(li)心機(ji)低(di)溫快(kuai)速(su)離(li)心30s，使(shi)得(de)引(yin)物(wu)幹(gan)粉(fen)匯(hui)聚到管(guan)底(di)，避(bi)免(mian)損(sun)失引(yin)物(wu)。收(shou)到(dao)引(yin)物(wu)後(hou)，需(xu)要(yao)先摸索引(yin)物(wu)的退火(huo)溫度(du)和終濃(nong)度(du)，以(yi)達(da)到(dao)較(jiao)理(li)想(xiang)的qPCR擴增效果(guo)，其(qi)次(ci)測定(ding)引(yin)物(wu)的擴增效率(lv)。

二(er)、反應體(ti)系配(pei)制技巧(qiao)

正式(shi)實驗(yan)時，每(mei)個樣(yang)本至少3個重(zhong)復，為(wei)了消(xiao)除(chu)各(ge)重(zhong)復之(zhi)間的系統(tong)誤(wu)差，將(jiang)所(suo)需(xu)的所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)和模板加(jia)在(zai)同(tong)壹個PCR管中，充分渦(wo)旋混勻後，再(zai)分裝(zhuang)到(dao)3個重(zhong)復孔中，這樣(yang)可(ke)有(you)效減小(xiao)系統(tong)誤(wu)差。另(ling)外，建(jian)議(yi)使(shi)用20μL以(yi)上(shang)的反(fan)應體(ti)積(ji)，以消(xiao)除(chu)由(you)於加(jia)樣(yang)不(bu)準造成(cheng)的系統(tong)誤(wu)差。

三(san)、陰性(xing)對照(zhao)的技(ji)巧(qiao)

   陰性(xing)對照(zhao)壹般(ban)是指(zhi)用水代(dai)替(ti)模板的反(fan)應孔，體(ti)系中除(chu)了(le)模板，包(bao)括了(le)其(qi)他的反(fan)應組(zu)分。由於(yu)qPCR的高(gao)靈敏(min)性(xing)，陰性(xing)對照(zhao)有出現(xian)擴增信號(hao)的情況，那麽(me)在(zai)針(zhen)對這類(lei)問(wen)題時，我們(men)需(xu)要(yao)判(pan)斷其(qi)原(yuan)因(yin)所(suo)在(zai)。使(shi)用染(ran)料法進(jin)行qPCR實驗(yan)時，首先查(zha)看陰性(xing)對照(zhao)的溶(rong)解(jie)曲線(xian)主(zhu)峰(feng)是否跟(gen)陽性(xing)孔的主(zhu)峰(feng)位置壹致(zhi)。如(ru)果(guo)不壹致(zhi)，則(ze)可(ke)能(neng)是(shi)引(yin)物(wu)性(xing)能不(bu)好(hao)，無模板或(huo)使用低(di)濃度(du)模板下會出現(xian)引(yin)物(wu)二(er)聚體(ti)，這種(zhong)情況則需(xu)要(yao)考(kao)慮(lv)更換引(yin)物(wu)，保(bao)證(zheng)引(yin)物(wu)特異(yi)性(xing)以及(ji)擴增效率(lv)。

四(si)、結果(guo)分析的技(ji)巧(qiao)

使用熒光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀(yi)進(jin)行相(xiang)對定(ding)量(liang)分析時，常用到(dao)的是(shi)2-ΔΔCq法，但(dan)是這種(zhong)方(fang)法比(bi)較(jiao)粗放(fang)，因為(wei)它的前(qian)提是(shi)假定(ding)所(suo)有(you)引(yin)物(wu)的擴增效率(lv)都(dou)為(wei)100%。更為(wei)準確(que)的定(ding)量(liang)則(ze)需(xu)要(yao)考(kao)慮(lv)不同(tong)引(yin)物(wu)擴增效率(lv)的差(cha)別。可(ke)先用梯度(du)稀(xi)釋的模板測試(shi)各(ge)引(yin)物(wu)的擴增效率(lv)E，獲得實際(ji)擴增效率(lv)之(zhi)後(hou)，後(hou)續實驗(yan)只(zhi)需(xu)要(yao)在(zai)軟(ruan)件(jian)中直接輸(shu)入(ru)擴增效率(lv)E值，即(ji)可(ke)計(ji)算(suan)更精準的相(xiang)對定(ding)量(liang)值。

通(tong)過(guo)對qPCR技術中引(yin)物(wu)操作技巧(qiao)、反應(ying)體(ti)系配(pei)制技巧(qiao)、陰性(xing)對照(zhao)技巧(qiao)以及(ji)結果(guo)分析技巧(qiao)的優化，可(ke)以(yi)在(zai)很大程度(du)上(shang)提高(gao)實(shi)驗(yan)結果(guo)的準確(que)性(xing)和可(ke)靠性(xing)。

Q2000B熒光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀(yi)采(cai)用目前進(jin)口(kou)半導(dao)體(ti)技(ji)術以及(ji) MARLOW 半導(dao)體(ti)芯(xin)片制造商生(sheng)產(chan)的半導(dao)體(ti)材(cai)料做為(wei)核(he)心部(bu)件，確(que)保(bao)產(chan)品的擴增速(su)度(du)、分析結果(guo)及(ji)系統(tong)可(ke)靠性(xing)，成(cheng)為(wei)目前PCR行業的主(zhu)流設(she)備。它具(ju)備多(duo)項先進(jin)功(gong)能，其(qi)屏(ping)幕(mu)可(ke)90°調節(jie)，適應(ying)不同視角需(xu)求(qiu)，確(que)保(bao)了操作的便(bian)利性(xing)；同時，它通(tong)過(guo)同步熒光(guang)檢(jian)測減少了延時誤(wu)差，提高(gao)了(le)數據準確(que)性(xing)。設(she)備自帶(dai)10英寸(cun)全真(zhen)彩(cai)觸(chu)控(kong)屏(ping)，允許用戶(hu)直(zhi)接在(zai)屏(ping)幕(mu)上(shang)編輯(ji)、查(zha)看和運(yun)行定(ding)量(liang)PCR及(ji)普(pu)通(tong)PCR程序(xu)，無需(xu)依(yi)賴(lai)電腦(nao)。采(cai)用新壹代半導(dao)體(ti)升降溫技術(shu)，擁(yong)有高(gao)達(da)6°C/SEC的變(bian)溫速率(lv)和100萬(wan)次(ci)循環(huan)的使(shi)用壽(shou)命(ming)。頂(ding)部(bu)檢(jian)測技術(shu)有(you)效屏(ping)蔽背景幹(gan)擾(rao)，提高(gao)熒光(guang)信號(hao)靈(ling)敏(min)度(du)和信噪比(bi)，兼(jian)容白管和透明管，確(que)保(bao)結果(guo)的準確(que)。此(ci)外，該(gai)還(hai)溫度(du)梯度(du)功(gong)能，便於優化反(fan)應條(tiao)件，並支(zhi)持遠(yuan)程(cheng)操控(kong)，實(shi)時查(zha)看實驗(yan)數據及(ji)分析結果(guo)。另外(wai)，采(cai)用SSLPTM短(duan)光(guang)程(cheng)靜(jing)態(tai)熒光(guang)CCD成(cheng)像技術(shu)，保證(zheng)了(le)熒光(guang)信號(hao)的穩(wen)定(ding)性(xing)和靈敏(min)度(du)。更(geng)多(duo)實驗(yan)室(shi)儀器(qi)請進入(ru)蘇(su)州阿(e)爾法生(sheng)物實(shi)驗(yan)器(qi)材(cai)有限公司(si)網(wang)站(zhan)咨詢。