質(zhi)粒(li)dna轉(zhuan)染(ran)真核(he)細(xi)胞方(fang)法(fa)有哪些(xie)？

質(zhi)粒(li)dna轉(zhuan)染(ran)真核(he)細(xi)胞方(fang)法(fa)有哪些(xie)？質(zhi)粒(li)dna轉(zhuan)染(ran)真核(he)包(bao)主(zhu)要有以下(xia)兩(liang)種方(fang)法(fa)：

1．生(sheng)化方(fang)法(fa)
（1）磷酸(suan)鈣介(jie)導(dao)的質(zhi)粒(li)DNA轉(zhuan)染(ran)真核(he)細(xi)胞
1）轉(zhuan)染(ran)前 24 h，通(tong)過(guo)胰(yi)酶(mei)消(xiao)化收集(ji)細(xi)胞，用適(shi)當的培養基(ji)以1×105至(zhi)4×105細(xi)胞 /cm2的密度平(ping)鋪細(xi)胞於(yu)60 mm組織(zhi)培養(yang)皿或12孔(kong)板(ban)上(shang)。於(yu)含 5%～7% CO2的(de)37℃溫(wen)箱(xiang)孵育20 ～24 h。轉(zhuan)染(ran)前1 h換(huan)液。
2） 按(an)照下(xia)屬方(fang)法(fa)制備(bei)磷(lin)酸(suan)鈣 -DNA沈(chen)澱：於(yu)5 ml滅菌(jun)塑(su)料管內混合100μl 2.5 mol/L CaCl2與(yu) 25μg質(zhi)粒(li)DNA，如(ru)有必要用(yong)0.1×TE（ pH7.6）將體(ti)積(ji)補(bu)至1 ml。室溫(wen)下將以(yi)上(shang)2×鈣 -DNA溶液與(yu)等體(ti)積(ji)的(de)2×HEPES鹽溶液混合。迅(xun)速(su)彈(dan)敲試(shi)管側壁混勻溶液，靜(jing)置(zhi)1 min 。
3）立即(ji)將磷(lin)酸鈣-DNA懸液轉(zhuan)移至上(shang)述單(dan)層(ceng)細(xi)胞的細(xi)胞培養基(ji)中(zhong)。每(mei)1 ml 培(pei)養(yang)基(ji)加(jia)0.1 ml懸液。輕輕搖動平(ping)皿混勻培養基(ji)，培養(yang)基(ji)會變成(cheng)混濁的橘(ju)黃(huang)色(se)。壹(yi)旦(dan)形(xing)成(cheng)DNA沈(chen)澱，轉(zhuan)染(ran)效率(lv)會(hui)大大(da)降低，因此(ci)此(ci)步(bu)動(dong)作(zuo)應(ying)盡(jin)可(ke)能(neng)迅(xun)速(su)。如果(guo)是用(yong)氯(lv)喹、甘(gan)油與(yu) /或丁(ding)酸(suan)鈉(na)處理細(xi)胞，直接進(jin)行步(bu)驟5。
4）如果(guo)轉(zhuan)染(ran)的細(xi)胞不用轉(zhuan)染(ran)促(cu)進(jin)劑(ji)處理，則(ze)置於(yu)含 5%~7%CO2的(de)37℃溫(wen)箱(xiang)孵育。2～ 6 h後，吸去培養(yang)基(ji)與(yu)DNA沈澱。加(jia)入(ru)5 ml 37 ℃預熱(re)的(de)培(pei)養(yang)基(ji)，將細(xi)胞放回(hui)孵箱(xiang)孵育1～6天。繼續(xu)步(bu)驟 6檢測轉(zhuan)染(ran)DNA的瞬(shun)時(shi)表達，或者(zhe)如果(guo)是穩(wen)定(ding)轉(zhuan)化則(ze)直接進(jin)行步(bu)驟7 。
5）在(zai)磷酸(suan)鈣-DNA沈(chen)澱物的(de)存(cun)在(zai)下用(yong)氯(lv)喹處(chu)理細(xi)胞或者(zhe)吸去(qu)沈(chen)澱溶液後將細(xi)胞暴(bao)露(lu)於(yu)甘油(you)與(yu)丁(ding)酸(suan)鈉(na)中(zhong)會(hui)促(cu)進(jin)細(xi)胞吸收 DNA。 
（2）用氯(lv)喹處(chu)理細(xi)胞
氯(lv)喹是壹(yi)種(zhong)弱(ruo)堿(jian)，推測是通(tong)過(guo)抑(yi)制細(xi)胞內溶酶(mei)體(ti)水(shui)解(jie)酶(mei)降解(jie)DNA 而發揮(hui)作用（Luthman and Magnusson 1983）。細(xi)胞對氯(lv)喹毒性的敏感度(du)限制了培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)加(jia)入(ru)氯(lv)喹的(de)濃度及時(shi)間(jian)，不同(tong)細(xi)胞所需氯(lv)喹最(zui)佳濃(nong)度(du)根據經驗而定(ding)。
1 ）在(zai)把磷酸(suan)鈣-DNA沈(chen)澱物加(jia)入(ru)細(xi)胞前或後按1： 1000將100 mmol/L氯(lv)喹直(zhi)接加(jia)入(ru)培養基(ji)中(zhong)。
2）細(xi)胞於(yu)含 5%~7%CO2的(de)37℃溫(wen)箱(xiang)中(zhong)孵育3~5 h。
3）在(zai)用DNA於(yu)氯(lv)喹孵育細(xi)胞後，移去培(pei)養(yang)基(ji)，用磷(lin)酸鹽緩(huan)沖(chong)液洗(xi)滌(di)細(xi)胞，加(jia) 5 ml預熱(re)的(de)培(pei)養(yang)基(ji)。細(xi)胞於(yu)孵箱(xiang)中(zhong)培(pei)養(yang)1～6 天。繼續(xu)步(bu)驟6檢測轉(zhuan)染(ran)DNA的瞬(shun)時(shi)表達，或者(zhe)直接進(jin)行步(bu)驟 7以獲(huo)得穩(wen)定(ding)轉(zhuan)化子(zi)。
（3）丁(ding)酸(suan)鈉(na)處理細(xi)胞
丁(ding)酸(suan)鈉(na)的作用機制並不(bu)確定(ding)；但(dan)它(ta)是組(zu)蛋(dan)白乙(yi)酰化形(xing)成(cheng)使(shi)外(wai)來(lai)質(zhi)粒(li)DNA趨(qu)於(yu)轉(zhuan)錄(lu)的染(ran)色(se)質(zhi)結(jie)構（Workman and Kingston 1998 ）。
1）甘油休(xiu)克處理後，將500 mmol/L丁(ding)酸(suan)鈉(na)直接加(jia)入(ru)生(sheng)長(chang)培養(yang)基(ji)（甘油(you)處理的步(bu)驟 d）。細(xi)胞類型不同(tong)，所(suo)用丁(ding)酸(suan)鈉(na)的濃度也不同。例如(ru)：
CV-1 10 mmol/L
NIH-3T3 7 mmol/L
HeLa 5 mmol/L
CHO 2 mmol/L
其(qi)他(ta)細(xi)胞系(xi)所需(xu)濃度依經驗而定(ding)。
2）細(xi)胞於(yu)孵箱(xiang)中(zhong)培(pei)養(yang)1~6 天。繼續(xu)步(bu)驟6檢測轉(zhuan)染(ran)DNA 的瞬(shun)時(shi)表達，或者(zhe)直接進(jin)行步(bu)驟7以獲(huo)得穩(wen)定(ding)轉(zhuan)化子(zi)。
6）若要檢(jian)測細(xi)胞轉(zhuan)染(ran)後導(dao)入(ru) DNA的瞬時(shi)表達，可在(zai)轉(zhuan)染(ran)後1~6天收獲(huo)細(xi)胞。雜(za)交分析(xi) DNA或RNA。通過(guo)體(ti)內代謝標(biao)記(ji)進(jin)行放射免疫(yi)、免疫(yi)印(yin)漬、免疫(yi)沈(chen)澱或測定(ding)細(xi)胞提取物的(de)酶(mei)活性來分析新合成(cheng)蛋(dan)白。
7）分(fen)離(li)穩(wen)定(ding)轉(zhuan)染(ran)體(ti)
(1)用(yong)非(fei)選擇(ze)性培養基(ji)孵育細(xi)胞24~48 h ，使(shi)轉(zhuan)染(ran)的DNA有足夠時(shi)間(jian)表達。 
(2) 胰(yi)酶(mei)消(xiao)化細(xi)胞並重鋪細(xi)胞於(yu)選擇(ze)性培養基(ji)中(zhong)，或者(zhe)直接加(jia)選擇(ze)性培養基(ji)/
(3)每 2~4天更換(huan)培(pei)養(yang)基(ji)，持續(xu)培(pei)養(yang)2~3周，目的是清除死細(xi)胞殘(can)骸(hai)，促(cu)進(jin)抗(kang)性細(xi)胞生(sheng)長(chang)。
(4)克隆(long)獨(du)立菌(jun)路、繁殖(zhi)，以用(yong)於(yu)檢測（方(fang)法(fa)見(jian)《細(xi)胞試(shi)驗手冊(ce)》的(de)第(di) 86章]）。
(6)用(yong)預冷(leng)的(de)甲(jia)醇(chun)固(gu)定(ding)細(xi)胞15 min ，然後室溫(wen)下用10% Giemsa染(ran)色(se) 15 min，流水(shui)沖(chong)洗(xi)，這樣(yang)可(ke)以(yi)記(ji)錄細(xi)胞克隆(long)數(shu)目。

2．物理方(fang)法(fa)
（1）電穿(chuan)孔(kong)轉(zhuan)染(ran)DNA
1）細(xi)胞生(sheng)長(chang)到(dao)對(dui)數(shu)中(zhong)期(qi)或晚期(qi)時(shi)收(shou)集細(xi)胞，用包有橡(xiang)皮的(de)玻璃棒或胰(yi)酶(mei)釋放貼壁細(xi)胞。 4℃、500g離(li)心(xin)5 min（Sorvall H1000B 轉(zhuan)子(zi)用(yong)1 500r/min）.
2）用0.5 體(ti)積(ji)的(de)初(chu)始培(pei)養基(ji)重懸細(xi)胞，用血(xue)細(xi)胞計數(shu)器(qi)計(ji)細(xi)胞數(shu)目。
3）離(li)心(xin)（同步(bu)驟1）收集(ji)細(xi)胞，室溫(wen)下用培(pei)養基(ji)或磷酸(suan)鹽緩(huan)沖(chong)液重(zhong)懸細(xi)胞至2.5×106~2.5×107 細(xi)胞/ml。
4）將400μl的(de)各(ge)等(deng)份(fen)細(xi)胞懸液（ 106～107細(xi)胞）加(jia)入(ru)標記(ji)好(hao)的電(dian)轉(zhuan)化池中(zhong)，冰浴。
5）設置電(dian)轉(zhuan)化參(can)數(shu)。壹(yi)般(ban)電(dian)容量為(wei)1050μF 。電壓(ya)在(zai)200 V和250 V之間(jian)，不同(tong)細(xi)胞系(xi)所需(xu)電壓(ya)不(bu)同，平(ping)均為(wei)260 V 。內部阻(zu)抗(kang)設為(wei)無(wu)窮大。進(jin)行電(dian)穿(chuan)孔(kong)前先(xian)用(yong)壹(yi)個(ge)裝(zhuang)有PBS的電(dian)轉(zhuan)化池放電至(zhi)少(shao)兩次(ci)。
6）每壹(yi)裝(zhuang)有細(xi)胞的電轉(zhuan)化池內加(jia)入(ru)10 ～30μg、體(ti)積(ji)最(zui)大可(ke)至(zhi)40μl的(de)質(zhi)粒(li)DNA 。用(yong)吸(xi)管將DNA與(yu)細(xi)胞輕輕混勻。立刻(ke)繼續(xu)進(jin)行第(di)7步(bu)。 
7）立(li)即(ji)將電(dian)轉(zhuan)化池移至電(dian)極(ji)間(jian)放電， 1～２min後，取出電(dian)轉(zhuan)化池，水(shui)浴，立(li)即(ji)進(jin)行下(xia)壹(yi)步(bu)操(cao)作(zuo)。
8）用(yong)帶有高壓(ya)滅(mie)菌(jun)吸(xi)頭(tou)的微(wei)量移液器(qi)將電(dian)穿孔(kong)的(de)細(xi)胞轉(zhuan)移至 35 mm培(pei)養(yang)皿中(zhong)。用(yong)等(deng)體(ti)積(ji)的(de)培養基(ji)洗滌(di)電(dian)轉(zhuan)化池，洗(xi)液加(jia)入(ru)培養皿。培(pei)養(yang)皿置(zhi)於(yu)含5%～7% CO2 的(de)37℃孵箱(xiang)。
9）重(zhong)復第(di)6 ～8步(bu)，電(dian)轉(zhuan)化所有DNA與(yu)細(xi)胞樣(yang)品(pin)。記(ji)錄下(xia)每壹(yi)電(dian)轉(zhuan)化池的(de)實(shi)際脈(mai)沖(chong)時(shi)間(jian)以便(bian)於(yu)比較(jiao)。 
10）如要獲(huo)得穩(wen)定(ding)轉(zhuan)化體(ti)，直(zhi)接進(jin)行第(di)11步(bu)。如(ru)果(guo)是瞬(shun)時(shi)表達，則(ze)於(yu)電穿(chuan)孔(kong)24 ～96 h後用下述方(fang)法(fa)之壹(yi)檢(jian)測細(xi)胞：
*如果使(shi)用(yong)的(de)是表達E.coli β- 半(ban)乳(ru)糖苷酶(mei)的質(zhi)粒(li)DNA，檢(jian)測細(xi)胞裂解(jie)液中(zhong)酶(mei)活性。
*如果使(shi)用(yong)綠(lv)色(se)熒光(guang)蛋(dan)白表達載體(ti)，在(zai)450~490 nm 光(guang)照下(xia)用顯(xian)微(wei)鏡(jing)檢測細(xi)胞。
*如果使(shi)用(yong)其(qi)它(ta)基(ji)因產物，則(ze)通過(guo)體(ti)內代謝標(biao)誌物進(jin)行放射免疫(yi)、免疫(yi)印(yin)漬、免疫(yi)沈(chen)澱或測定(ding)細(xi)胞提取物的(de)酶(mei)活性來分析新合成(cheng)蛋(dan)白。
11）分(fen)離(li)穩(wen)定(ding)轉(zhuan)染(ran)體(ti)：用(yong)培(pei)養基(ji)培養(yang) 48~72 h後，胰(yi)酶(mei)消(xiao)化細(xi)胞，用適(shi)當的選擇(ze)性培養基(ji)重鋪細(xi)胞。每2~4天換(huan)液壹(yi)次(ci)，持續(xu)2~3 周，目的是去(qu)除死細(xi)胞殘(can)骸(hai)，並允(yun)許抗(kang)性細(xi)胞克隆(long)生(sheng)長(chang)。

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