瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠(jiao)電(dian)泳(yong)實(shi)驗方法步驟(zhou)

瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝(ning)膠電(dian)泳(yong)實(shi)驗步驟(zhou)：

(1)安(an)裝(zhuang)電(dian)泳(yong)管(guan)

選擇(ze)聚含均(jun)勻(yun)、無氣(qi)泡、無(wu)裂縫(feng)、膠面(mian)平整(zheng)並(bing)與管(guan)壁(bi)沒有(you)脫(tuo)離(li)現(xian)象的(de)合(he)格(ge)凝膠電(dian)泳(yong)管(guan) 插入(ru)上(shang)電(dian)極槽(cao)底板的(de)各(ge)圓孔(kong)中，留1/5在(zai)底板上(shang)方，保(bao)證使電(dian)泳(yong)管(guan)與底板垂(chui)直，密(mi)封(feng)處不(bu) 致滲(shen)漏。

(2) 加樣(yang)

可(ke)利用(yong)上(shang)述方法制成樣品膠，也(ye)可(ke)以(yi)用(yong)如下(xia)的(de)壹(yi)種(zhong)方法加(jia)樣。

將(jiang)樣(yang)品溶(rong)於(yu)200mg/ml濃(nong)度(du)的(de)蔗(zhe)糖(tang)溶(rong)液(ye)中，或溶(rong)在(zai)10%甘油中，然後(hou)加在(zai)濃縮(suo)膠(jiao)的(de) 表(biao)面(mian)。

或將熔(rong)化(hua)的(de)瓊(qiong)脂(zhi)與樣(yang)品溶(rong)液(ye)混(hun)合(he)後(hou)加在(zai)濃縮(suo)膠(jiao)表(biao)面。

或用(yong)與電(dian)泳(yong)管(guan)內徑相(xiang)近(jin)的(de)圓(yuan)形(xing)厚(hou)濾紙片(pian)，將(jiang)樣(yang)品溶(rong)液(ye)吸(xi)收後(hou)，緊(jin)貼(tie)在(zai)濃縮(suo)膠(jiao)表(biao)面。 如樣(yang)品是固(gu)體(ti)，應(ying)先(xian)溶(rong)在(zai)濃縮(suo)膠(jiao)緩(huan)沖液(ye)中，並(bing)加(jia)入(ru)足夠(gou)量(liang)lmol/L的(de)蔗(zhe)糖(tang)溶(rong)液(ye)，使樣(yang) 品溶(rong)液(ye)的(de)比重(zhong)增(zeng)大，再(zai)加(jia)在(zai)濃縮(suo)膠(jiao)表(biao)面.

必須保(bao)證樣品溶(rong)液(ye)具(ju)有(you)低(di)電(dian)導性，鹽濃度(du)不(bu)應(ying)超(chao)過0. 05mol/L_o

目(mu)前(qian)常(chang)用(yong)的(de)加(jia)樣(yang)方法是(shi)：用(yong)稀(xi)釋(shi)5-10倍的(de)濃(nong)縮(suo)膠(jiao)緩(huan)沖液(ye)，使其(qi)成(cheng)lmg/ml的(de)濃(nong) 度(du)，再加蔗糖使成(cheng)濃(nong)度(du)，然後(hou)在(zai)濃縮(suo)膠(jiao)面(mian)上(shang)有電(dian)極緩(huan)沖液(ye)存在(zai)的(de)情(qing)況(kuang)下(xia)，用(yong)合(he) 適(shi)的(de)加(jia)樣(yang)工(gong)具(ju)如微(wei)堇(jin)註射器(qi)，插(cha)入(ru)濃縮(suo)膠(jiao)面(mian)與上(shang)方的(de)電(dian)極緩(huan)沖液(ye)界面處，輕輕地將樣品加 在(zai)濃縮(suo)膠(jiao)面(mian)上(shang).

(3) 加電(dian)泳(yong)緩(huan)沖液(ye)

樣品加入(ru)後，在(zai)上(shang)下兩(liang)個電(dian)泳(yong)槽(cao)中灌註電(dian)極緩(huan)沖液(ye)，緩(huan)沖液(ye)的(de)溫(wen)度(du)需(xu)與電(dian)泳(yong)溫(wen)度(du)壹 致。加入(ru)緩(huan)沖液(ye)時應(ying)小(xiao)心操(cao)作(zuo)，不(bu)能攪動電(dian)泳(yong)管(guan)中的(de)樣(yang)品溶(rong)液(ye)，並(bing)不(bu)使電(dian)泳(yong)管(guan)上(shang)下口(kou)留有(you) 氣(qi)泡。緩(huan)沖液(ye)的(de)用(yong)垃(la)隨容器(qi)的(de)大小(xiao)而(er)有異(yi)。壹般(ban)情(qing)況(kuang)下(xia)電(dian)極槽(cao)中的(de)緩(huan)沖液(ye)量(liang)能使電(dian)泳(yong)管(guan) 至(zhi)少有3/5浸(jin)入(ru)緩(huan)沖液(ye)為(wei)宜(yi)。

(4) 加指(zhi)示(shi)染料(liao)

對(dui)於(yu)電(dian)泳(yong)系(xi)統(tong)常(chang)用(yong)的(de)指(zhi)示(shi)染料(liao)為(wei)0. 001%溴(xiu)酚(fen)藍(lan)，酸(suan)性(xing)系統(tong)常(chang)用(yong)的(de)是(shi)0. 005%甲(jia)基(ji)綠(lv) 或甲(jia)烯(xi)藍(lan)。用(yong)量(liang)為(wei)每(mei)500ml緩(huan)沖液(ye)加指(zhi)示(shi)染料(liao)1ml_D 壹(yi)般(ban)加(jia)在(zai)上(shang)電(dian)泳(yong)槽(cao)緩(huan)沖液(ye)中。

(5) 瓊(qiong)脂糖凝膠(jiao)電(dian)泳(yong)

在(zai)電(dian)泳(yong)槽(cao)上(shang)裝配(pei)好(hao)電(dian)極，接(jie)通(tong)直流(liu)電(dian)源。堿(jian)性(xing)系(xi)統(tong)上(shang)電(dian)極接(jie)負(fu)極(ji)，酸(suan)性系(xi)統(tong)上(shang)電(dian)極接(jie)正(zheng)極。

對(dui)於(yu)直徑5〜7mm的(de)凝(ning)膠(jiao)，初(chu)2分鐘(zhong)用(yong)1mA/管的(de)電(dian)流(liu)進行(xing)電(dian)泳(yong)，然後(hou)逐漸升高(gao)到(dao) 2〜5mA/管（10分鐘(zhong)）。通常(chang)5mm X 65mm的(de)凝(ning)膠(jiao)在(zai)20 C時用(yong)4mA/管進(jin)行電(dian)泳(yong),大約(yue)需(xu)時40分鐘(zhong)。

在(zai)電(dian)泳(yong)過程中，常(chang)要(yao)求(qiu)電(dian)流(liu)保(bao)持(chi)恒(heng)定(ding)。此(ci)時，電(dian)壓會有(you)升高(gao)。如果(guo)電(dian)流(liu)大而(er)產(chan)生(sheng)過高(gao) 的(de)歐(ou)姆熱(re)，影(ying)響(xiang)某些(xie)樣品時，可(ke)以(yi)降(jiang)低(di)電(dian)流(liu)而延(yan)長(chang)電(dian)泳(yong)時(shi)間。

   電(dian)泳(yong)時(shi)間的(de)長(chang)短(duan)與所(suo)用(yong)電(dian)流(liu)和(he)凝膠(jiao)的(de)長(chang)度(du)有關。為(wei)了(le)節(jie)約時(shi)間也(ye)可(ke)以(yi)使用(yong)天(tian)能預(yu)制膠。但即使應(ying)用(yong)同樣長(chang)度(du)的(de)凝(ning)膠(jiao)，也(ye)會因凝(ning)膠(jiao)系統(tong)和(he) 樣品性質的(de)不(bu)同，而使電(dian)泳(yong)時(shi)間有差別。對(dui)於(yu)壹般(ban)的(de) 分析(xi)工(gong)作來(lai)說，如指(zhi)示(shi)染料(liao)已(yi)遷移至(zhi)距凝(ning)膠下(xia)端3〜 6mm時,就(jiu)可(ke)停(ting)止電(dian)泳(yong)，切斷電(dian)源,取出電(dian)泳(yong)管(guan)。電(dian)極緩(huan)沖液(ye)可(ke)重(zhong)復(fu)使用(yong)若幹次，上(shang)下電(dian)極緩(huan)沖 液(ye)壹般(ban)不(bu)要(yao)混合(he)貯(zhu)存，也(ye)不(bu)要(yao)將前(qian)壹(yi)次(ci)的(de)負(fu)極(ji)緩(huan)沖 液(ye)作下壹次電(dian)泳(yong)時(shi)的(de)正(zheng)極緩(huan)沖液(ye)。因為(wei)經(jing)電(dian)泳(yong)後(hou)，二(er) 電(dian)極的(de)緩(huan)沖液(ye)組成已有了(le)變(bian)化(hua)。

 有(you)時候，我們(men)需(xu)要(yao)進行(xing)長(chang)時(shi)間的(de)電(dian)泳(yong)。例(li)如:DNA的(de)分離(li)有(you)時(shi)長(chang)達(da)10余小(xiao)時(shi)。為(wei)了(le)防 止由(you)於(yu)電(dian)極反(fan)應(ying)使緩(huan)沖能(neng)力耗盡從而引起(qi)pH的(de)變(bian)化(hua)影(ying)響分離(li)，1977年(nian)美國(guo)匹(pi)茲堡(bao)大學(xue) T.G. Cooper提出用(yong)循(xun)環(huan)緩(huan)沖液(ye)的(de)辦(ban)法來(lai)保(bao)持(chi)緩(huan)沖能(neng)力不(bu)致耗(hao)盡，以(yi)達(da)到(dao)緩(huan)沖溶(rong)液(ye)能(neng)較(jiao) 長(chang)期(qi)使用(yong)的(de)目(mu)的(de)。

上(shang)下兩(liang)個電(dian)泳(yong)槽(cao)的(de)緩(huan)沖溶(rong)液(ye)水平(ping)保(bao)持(chi)恒(heng)定(ding)，但(dan)又沒(mei)有(you)建立通路(lu)。下(xia)槽(cao)的(de)緩(huan)沖液(ye)可(ke)靠輸(shu) 液(ye)器(qi)壹(yi)滴壹(yi)滴地滴入(ru)上(shang)槽(cao)。而(er)當上(shang)槽(cao)的(de)緩(huan)沖液(ye)增(zeng)加(jia)時，就(jiu)會經(jing)溢流(liu)管滴回(hui)到(dao)下槽(cao)，使上(shang)下 兩(liang)槽(cao)的(de)緩(huan)沖液(ye)水平(ping)在(zai)電(dian)泳(yong)過程中始終保(bao)持(chi)恒(heng)定(ding)。要(yao)註意的(de)是(shi),滴入(ru)上(shang)槽(cao)中的(de)緩(huan)沖液(ye)，必須 不(bu)是線(xian)狀(zhuang)連續(xu)的(de)。 

瓊脂糖(tang)凝(ning)膠(jiao)的(de)取(qu)出

電(dian)泳(yong)結束取出電(dian)泳(yong)管(guan)。然後(hou),用(yong)配(pei)有細(xi)長(chang)針(zhen)頭並(bing)盛(sheng)有水的(de)註射器(qi)，將(jiang)針(zhen)頭小(xiao)心地插入(ru) 凝膠(jiao)和(he)玻璃(li)管壁(bi)之(zhi)間，邊(bian)插入(ru)轉動管子同時壓(ya)進(jin)壹些(xie)水，另(ling)壹(yi)端也(ye)作同樣處(chu)理(li)。然後(hou)，將管F套上(shang)橡皮(pi)管(guan)用(yong)自來(lai)水壓(ya)力(li)壓出凝(ning)膠(jiao)，或用(yong)洗耳(er)球壓(ya)岀凝膠(jiao)。如果(guo)壓岀凝膠(jiao)困(kun)難(nan)時(shi)，註射 器(qi)內可(ke)裝甘油代替(ti)水壓(ya)入(ru)凝膠(jiao)和(he)管壁(bi)之(zhi)間。也(ye)可(ke)以(yi)用(yong)壹根(gen)金屬細(xi)絲，從(cong)凝(ning)膠和(he)管壁(bi)之(zhi)間穿(chuan) 過整(zheng)個(ge)玻璃(li)管，然後(hou)，拉緊金屬(shu)細(xi)絲轉動玻璃(li)管壹(yi)周，就(jiu)能(neng)使凝(ning)膠(jiao)脫離(li)管(guan)壁(bi)，再用(yong)洗耳(er)球擠(ji) 壓，就(jiu)很容易壓出。

也(ye)可(ke)以(yi)將(jiang)電(dian)泳(yong)管(guan)浸入(ru)甲(jia)醇(chun)中，使凝(ning)膠(jiao)收縮(suo)與管(guan)壁(bi)脫離(li)而(er)取(qu)岀，或根(gen)據具(ju)體(ti)條件(jian)用(yong)別的(de) 辦(ban)法取(qu)出凝(ning)膠(jiao)。但必須註意，無(wu)論(lun)用(yong)何種(zhong)辦(ban)法，必須不(bu)損(sun)傷膠(jiao)面(mian)。特別是(shi)濃(nong)度(du)低的(de)大孔(kong)凝 膠(jiao)，機(ji)械強度(du)差，取岀時應(ying)格(ge)外(wai)小(xiao)心。