懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞電穿孔(kong)轉(zhuan)染法(fa)的實(shi)驗(yan)流(liu)程詳(xiang)解

[實(shi)驗(yan)原(yuan)理(li)]
  當細(xi)胞置(zhi)於(yu)非(fei)常高(gao)的電場中(zhong)，細(xi)胞膜(mo)就變得(de)具(ju)有(you)通透(tou)性(xing)，能(neng)讓(rang)外界(jie)的分(fen)子(zi)擴散進(jin)細(xi)胞內(nei)，這壹(yi)現象(xiang)稱(cheng)為(wei)電(dian)穿孔(kong)。運(yun)用這(zhe)壹(yi)技術(shu)，許(xu)多物(wu)質(zhi)，包(bao)括(kuo)DNA、RNA、蛋(dan)白質(zhi)、藥(yao)物(wu)、抗(kang)體(ti)和(he)熒(ying)光(guang)探針都能(neng)載入細(xi)胞。作(zuo)為(wei)壹(yi)種基因轉(zhuan)導(dao)方法(fa)，電穿孔(kong)已被(bei)廣(guang)泛用於(yu)各種細(xi)胞類(lei)型，包(bao)括(kuo)細(xi)菌、酵母(mu)、植(zhi)物(wu)和(he)動物(wu)細(xi)胞；而且，它還能(neng)作(zuo)為(wei)註(zhu)射方法(fa)（稱(cheng)為(wei)電(dian)註(zhu)射），把(ba)各種外源(yuan)物(wu)質(zhi)引入活細(xi)胞。與(yu)其(qi)他(ta)常用的(de)導入外源(yuan)物(wu)質(zhi)的(de)方法(fa)相(xiang)比，電(dian)穿孔(kong)具(ju)有(you)很(hen)多(duo)優(you)點(dian)。

壹(yi).不必(bi)象(xiang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)那樣(yang)使用(yong)玻璃針，不需要技術(shu)培訓(xun)和(he)昂(ang)貴(gui)的設備，可(ke)以壹(yi)次對(dui)成(cheng)百(bai)萬(wan)的(de)細(xi)胞進行註(zhu)射。

二.與(yu)用化學(xue)物(wu)質(zhi)相(xiang)比，電(dian)穿孔(kong)幾乎(hu)沒(mei)有生(sheng)物(wu)或(huo)化學(xue)副作(zuo)用(yong)。

三(san).因(yin)為(wei)電(dian)穿孔(kong)是(shi)壹(yi)種物(wu)理(li)方法(fa)，較少依(yi)賴(lai)細(xi)胞類(lei)型，因(yin)而(er)應(ying)用廣泛。實(shi)際上，對(dui)大多(duo)數細(xi)胞類(lei)型，用(yong)電(dian)穿孔(kong)法基(ji)因(yin)的轉(zhuan)移效(xiao)率比化學(xue)方法(fa)高(gao)得多。
除(chu)了(le)能(neng)使細(xi)胞膜(mo)具(ju)有(you)通透(tou)性(xing)，讓(rang)外界(jie)的分(fen)子(zi)擴散入胞液中(zhong)以外，高(gao)強(qiang)度的電場脈沖(chong)也(ye)能(neng)引起細(xi)胞融(rong)合(he)，這壹(yi)現象(xiang)叫(jiao)做(zuo)電(dian)融(rong)合(he)。然(ran)而，在用(yong)電脈沖(chong)融(rong)合(he)前必(bi)須(xu)使(shi)細(xi)胞相(xiang)互(hu)緊密(mi)接觸，這壹(yi)電融(rong)合(he)方法(fa)在原生(sheng)質(zhi)融(rong)合(he)制取(qu)雜交(jiao)植物(wu)，胚(pei)胎(tai)細(xi)胞相(xiang)互(hu)融(rong)合(he)制備動物(wu)克(ke)隆(long)方面(mian)非(fei)常有用(yong)，尤其(qi)在(zai)制取(qu)雜交(jiao)瘤細(xi)胞制備單(dan)克(ke)隆(long)抗(kang)體方面(mian)用處很大。幾個(ge)實(shi)驗(yan)室已證(zheng)明使(shi)用電(dian)場電融(rong)合(he)效率比(bi)常規(gui)的(de)化學(xue)融(rong)合(he)方法(fa)高(gao)10到100倍，最近，貼(tie)壁(bi)細(xi)胞的電融(rong)合(he)還被(bei)用來(lai)研究(jiu)細(xi)胞融(rong)合(he)時(shi)細(xi)胞的骨架成(cheng)分和(he)細(xi)胞器的動力(li)學(xue)重(zhong)排。
[儀(yi)器、材(cai)料和(he)試劑]
（壹(yi)）儀(yi)器：
脈沖(chong)發(fa)生(sheng)器(qi)，樣(yang)品池(chi)：壹(yi)個(ge)盛細(xi)胞的容器和(he)兩(liang)個(ge)平(ping)行的(de)金(jin)屬(shu)電極，CO2培養箱，離(li)心(xin)機，顯微(wei)鏡(jing)，微(wei)量(liang)移液(ye)器，鑷子(zi)，剪刀，三角(jiao)瓶，吸管，毛(mao)細(xi)管，離(li)心(xin)管等(deng)。
（二）材(cai)料：
（三(san)）試劑：
穿孔(kong)介(jie)質(zhi)（PM）：15mmol/L磷酸(suan)鉀　1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗(zhe)糖（或甘(gan)露(lu)醇）　10mmol/L HEPES　調(tiao)節(jie)pH至7.3
融(rong)合(he)介(jie)質(zhi)（FM）：1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘(gan)露(lu)醇　2mmol/L HEPES　調(tiao)節(jie)pH至7.3

[方法(fa)與(yu)步驟]

壹(yi)．懸浮(fu)細(xi)胞的電穿孔(kong)法：

1電(dian)穿孔(kong)進行(xing)基(ji)因轉(zhuan)移
電(dian)穿孔(kong)可用(yong)於(yu)將多種(zhong)不同(tong)類(lei)型的(de)分(fen)子(zi)載入活細(xi)胞中(zhong)，操作(zuo)步驟非(fei)常相(xiang)似。以下我(wo)們用基(ji)因(yin)轉(zhuan)移作(zuo)為(wei)例(li)子(zi)。載入其(qi)他(ta)的分子(zi)可按(an)以下相(xiang)同(tong)步驟進(jin)行，只(zhi)需(xu)把(ba)外源(yuan)DNA換(huan)頁(ye)所需(xu)分子(zi)即可(ke)。
1.1　使(shi)細(xi)胞在適(shi)宜的(de)培養基中(zhong)生(sheng)長，用(yong)胰(yi)酶(mei)處理(li)，收(shou)獲(huo)對(dui)數生(sheng)長中(zhong)期的(de)細(xi)胞，並(bing)用腺(xian)酶(mei)處(chu)理(li)。
1.2　在穿孔(kong)介(jie)質(zhi)（PM）中(zhong)至少洗壹(yi)次。洗細(xi)胞時(shi)，在(zai)臺式(shi)離(li)心(xin)機上1000rpm離(li)心(xin)3分鐘(zhong)，使(shi)得(de)懸浮(fu)細(xi)胞沈降。然(ran)後，去掉(diao)上清液，在新(xin)的(de)介(jie)質(zhi)中(zhong)重(zhong)新(xin)懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞。
1.3　計(ji)數細(xi)胞，在PM中(zhong)，濃(nong)縮細(xi)胞為大約1千萬細(xi)胞/ml。
1.4　將DNA加到細(xi)胞懸液中(zhong)，充分(fen)混合(he)，使DNA均勻(yun)分散，用(yong)吸管吸壹(yi)定體積(ji)的(de)細(xi)胞-DNA混合(he)液到裝(zhuang)有電(dian)極的(de)滅(mie)菌(jun)小(xiao)樣(yang)品池(chi)中(zhong)。
1.5　在電(dian)穿孔(kong)裝(zhuang)置(zhi)上設置(zhi)輸(shu)出電壓和(he)脈沖(chong)寬(kuan)度（脈沖(chong)寬(kuan)度是(shi)指數(shu)衰減函(han)數(shu)的(de)時(shi)間(jian)常數，即(ji)τ=RC，C是(shi)電容，R是(shi)樣(yang)品的(de)電阻(zu)）。假(jia)如設備是(shi)CD脈沖(chong)型(xing)發(fa)生(sheng)器(qi)，設定電(dian)容和(he)並(bing)聯(lian)電(dian)阻(zu)，以達到合(he)適(shi)的τ值(zhi)。
1.6　將小(xiao)池(chi)放(fang)進(jin)盛樣(yang)品的(de)池(chi)中(zhong)，啟動電(dian)穿孔(kong)裝(zhuang)置(zhi)，供(gong)給所需的(de)電(dian)脈沖(chong)。
1.7　電(dian)處(chu)理(li)後，向(xiang)小池(chi)加(jia)1ml普(pu)通培養基，將細(xi)胞混合(he)液從小(xiao)池(chi)轉(zhuan)移到(dao)組(zu)織(zhi)培養容器（培養皿(min)或(huo)培養孔）中(zhong)，再加(jia)入壹(yi)些培養基使最終的培養基體積(ji)適(shi)量。然(ran)後，將樣(yang)品細(xi)胞放回(hui)孵育箱中(zhong)使之(zhi)在正常條件(jian)下生(sheng)長。
1.8　在(zai)測定轉(zhuan)移基(ji)因的表(biao)達量前(qian)電穿孔(kong)細(xi)胞各自培養的時(shi)間(jian)不同(tong)。

2檢測電穿孔(kong)效率(lv)和(he)細(xi)胞存活率

2.1 除(chu)用羅丹(dan)明偶聯(lian)葡(pu)聚糖（1mg/ml）（分子(zi)探針）代替DNA外，將羅(luo)丹(dan)明偶聯(lian)葡(pu)聚糖引入目標細(xi)胞的方法(fa)如前所(suo)述。
2.2 電(dian)穿孔(kong)後，用(yong)培養基洗滌(di)細(xi)胞兩(liang)次(ci)，去掉(diao)胞外的熒(ying)光(guang)葡(pu)聚糖。
2.3 電穿孔(kong)後30min，向(xiang)細(xi)胞懸液中(zhong)加30μl臺盼(pan)藍(lan)，孵育2min，然(ran)後用培養基洗滌(di)。
2.4 在(zai)1000rpm下離(li)心(xin)3min，收(shou)集(ji)細(xi)胞，將細(xi)胞重(zhong)懸於(yu)PM中(zhong)，終體積(ji)100μl。
2.5 將(jiang)壹(yi)滴細(xi)胞液（30μl）置(zhi)於(yu)幹凈載(zai)玻片(pian)上，用蓋(gai)玻片(pian)蓋(gai)好(hao)，在顯(xian)微(wei)鏡(jing)下檢(jian)測細(xi)胞，測定攝取(qu)熒(ying)光標記葡(pu)聚糖的百(bai)分(fen)數(shu)。
2.6 在(zai)亮(liang)視野鏡片(pian)下，死(si)細(xi)胞可因染成(cheng)藍色(se)檢(jian)測出（攝取(qu)了(le)臺盼(pan)藍(lan)），測定細(xi)胞存活的百(bai)分(fen)數(shu)。
2.7 在(zai)各種電場設定值(zhi)下重(zhong)復實(shi)驗(yan)，畫(hua)出(chu)攝取(qu)葡(pu)聚糖率和(he)細(xi)胞存活率對(dui)電穿孔(kong)參數(shu)的(de)曲(qu)線。這(zhe)壹(yi)曲(qu)線就(jiu)將(jiang)顯示對(dui)特定(ding)細(xi)胞類(lei)型電(dian)穿孔(kong)的合(he)適(shi)條件(jian)。