細胞轉染方法之(zhi)-磷酸(suan)鈣(gai)沈澱(dian)法

【實(shi) 驗 原(yuan) 理】

磷(lin)酸(suan)鈣(gai)沈澱(dian)法是基(ji)於磷酸(suan)鈣(gai)-DNA復(fu)合物的壹(yi)種(zhong)將(jiang)DNA導入(ru)真核細胞的轉染方法。磷(lin)酸(suan)鈣(gai)有(you)利於促進外源DNA與靶細胞表面(mian)的(de)結合。磷(lin)酸(suan)鈣(gai)-DNA復(fu)合物粘附(fu)到(dao)細胞膜(mo)並通過胞(bao)飲作用進入靶細胞，被轉染的DNA可(ke)以(yi)在細胞內進行瞬(shun)時(shi)表達，也(ye)可(ke)整合到(dao)靶細胞的染色體上從而產(chan)生不同(tong)基(ji)因(yin)型(xing)和(he)表型(xing)的(de)穩(wen)定克(ke)隆(long)。該(gai)方(fang)法可(ke)廣(guang)泛用(yong)於轉染許多(duo)不同(tong)類型(xing)的(de)細胞。

【儀器(qi)、材料和(he)試劑】

（壹(yi)）儀(yi)器(qi)、用具(ju)

CO2培養箱(xiang)^[1]、10cm細胞培養(yang)平(ping)板、巴斯(si)德(de)吸管、微(wei)量(liang)移液(ye)器^[2]、15ml錐(zhui)形管、燒(shao)杯(bei)、量筒等(deng)。

（二）材料

呈(cheng)指數生長(chang)的(de)真(zhen)核細胞BALB/c 3T3

CsCl純化的(de)表(biao)達質(zhi)粒DNA

（三(san)）試(shi)劑

1．培養(yang)基(ji)

DMEM 90ml

FCS 10ml

2．2M CaCl2，過(guo)濾(lv)除菌，-20℃保(bao)存(cun)備用

3．2×HEBS (g/500ml)

NaCl 8.0

KCl 0.38

Na2HPO4.7H2O 0.19

HEPES 5.0

葡萄(tao)糖(tang) 1.0

用NaOH調(tiao)pH至(zhi)6.95，過(guo)濾(lv)除菌後，-20℃保(bao)存(cun)備用。

【方法與(yu)步(bu)驟(zhou)】

1．在10cm的(de)培養(yang)板(ban)上接(jie)種(zhong)1×106個(ge)BALB/c 3T3細胞

第二天進行轉染

2．準備CaPO4沈澱(dian)

2.1 準(zhun)備兩組試管

在(zai)A管中(zhong)加(jia)入： 15μg質(zhi)粒DNA

69μl 2M CaCl2

460μl重蒸水(shui)

在B管中(zhong)加(jia)入： 550μl 2×HEBS

2.2 用(yong)巴斯(si)德(de)吸管將(jiang)A管中(zhong)的(de)溶液(ye)緩慢地(di)逐滴(di)加入在B管中(zhong)，同(tong)時(shi)用另壹(yi)吸管吹(chui)打(da)B管溶液(ye)，整個(ge)過程需(xu)緩慢進行，至(zhi)少需(xu)持續(xu)1～2min。

2.3室(shi)溫(wen)靜(jing)置(zhi)30min，出現(xian)細小(xiao)顆(ke)粒沈澱(dian)。

3. 小(xiao)心地(di)將沈澱(dian)逐(zhu)滴(di)均勻地(di)加入(ru)培養細胞的10cm平(ping)板中(zhong)，輕輕晃動（此過程需(xu)盡快完成）。

4. 在5%CO2的(de)加濕(shi)培(pei)養(yang)箱(xiang)中培養細胞2-6 hr。

5. 除去培養(yang)液(ye)，加入(ru)10ml培養(yang)基(ji)培(pei)養(yang)細胞1-6天（依具(ju)體情(qing)況(kuang)而定(ding)）。

6. 收(shou)集細胞進行基(ji)因(yin)活(huo)性的檢測，或分散接(jie)種(zhong)到其(qi)他(ta)培(pei)養(yang)皿(min)中(zhong)進行選擇(ze)培(pei)養(yang)。

【註(zhu) 意(yi) 事(shi) 項】

1．在整個(ge)轉染過程中(zhong)要(yao)保(bao)持無(wu)菌操(cao)作。

2．在(zai)實(shi)驗(yan)中使用(yong)的各(ge)種試劑都必(bi)須(xu)小(xiao)心校(xiao)準(zhun)，保證(zheng)質(zhi)量(liang)。

3．質(zhi)粒DNA 需CsCl純化，乙(yi)醇沈澱(dian)後的(de)DNA應保(bao)持無(wu)菌，在(zai)無(wu)菌水(shui)或Tris- EDTA中(zhong)溶解。

4．沈澱(dian)物的大小(xiao)和(he)質(zhi)量(liang)對於磷酸(suan)鈣(gai)轉染的成(cheng)功至關(guan)重要(yao)。在(zai)磷(lin)酸(suan)鹽溶液(ye)中加(jia)入DNA-CaCl2溶液(ye)時(shi)需用空(kong)氣吹(chui)打(da)，以確(que)保形成盡可(ke)能(neng)細小(xiao)的沈澱(dian)物，因為(wei)成團(tuan)的DNA不能有(you)效地(di)黏附(fu)和(he)進入細胞。

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