人(ren)臍(qi)靜(jing)脈內皮(pi)細(xi)胞HUVEC培(pei)養技術

人(ren)臍(qi)靜(jing)脈內皮(pi)細(xi)胞（HUVEC）的(de)培養是壹項(xiang)重要的(de)細(xi)胞培(pei)養技術。下面將詳細(xi)介(jie)紹(shao)HUVEC的(de)培養步(bu)驟(zhou)，並分享壹些(xie)經驗(yan)。

1. 準(zhun)備工(gong)作(zuo)：

   a. 15-20cm長(chang)的(de)新生(sheng)兒(er)臍(qi)帶(dai)放(fang)入(ru)無(wu)菌的(de)PBS溶液(ye)中(zhong)儲存。

   b. 註意臍帶最(zui)多貯(zhu)存24小(xiao)時在(zai)4℃下，室(shi)溫(wen)下不(bu)超過6小(xiao)時。

2. 洗滌臍(qi)帶(dai)：

   a. 使用(yong)壹個(ge)鈍(dun)頭(tou)的(de)針(zhen)頭(tou)紮(zha)入(ru)臍(qi)帶靜脈管(guan)中(zhong)，用無(wu)菌的(de)PBS溶液(ye)沖洗3-5次，直至(zhi)汙(wu)血(xue)沖(chong)洗幹(gan)凈(jing)。

3. 消(xiao)化(hua)臍(qi)帶：

   a. 用(yong)手術(shu)鉗(qian)夾(jia)緊(jin)臍(qi)帶(dai)下端，加入(ru)15ml的(de)膠原酶（1mg/ml）室(shi)溫(wen)下消(xiao)化(hua)15-20分(fen)鐘，並(bing)不時上(shang)下搖(yao)動(dong)臍(qi)帶(dai)。

4. 收集消(xiao)化(hua)液(ye)：

   a. 消(xiao)化(hua)完(wan)後，將下端手術(shu)鉗(qian)松開(kai)，消(xiao)化(hua)液(ye)流(liu)入(ru)壹個(ge)50ml無(wu)菌離(li)心管(guan)中(zhong)，用無(wu)菌的(de)PBS溶液(ye)沖洗臍帶2-3次。

5. 離(li)心：

   a. 將收集液(ye)離(li)心（2000轉(zhuan)/分）3分(fen)鐘。

6. 轉(zhuan)移(yi)到(dao)培(pei)養瓶中(zhong)：

   a. 倒去上(shang)清(qing)，加入(ru)10ml M199培(pei)養基(ji)（加(jia)入(ru)10U/ml的(de)bFGF），用彎管(guan)吹散(san)細(xi)胞，將所有(you)液體(ti)轉(zhuan)入(ru)壹個(ge)用明(ming)膠包被好的(de)培養瓶中(zhong)，37℃培養。

   b. 在(zai)每(mei)個(ge)培養瓶中(zhong)加入(ru)3-4ml無(wu)菌的(de)1%明膠(jiao)溶液，搖(yao)勻(yun)使得(de)明(ming)膠溶(rong)液鋪滿瓶底，放(fang)入(ru)37℃孵育(yu)，最(zui)少(shao)2小(xiao)時，用(yong)前將明膠(jiao)溶液倒掉(diao)即(ji)可。明膠包被有(you)利(li)於(yu)細(xi)胞貼(tie)壁。

7. 培養細(xi)胞：

   a. 培(pei)養24小(xiao)時後(hou)，倒掉(diao)培(pei)養基(ji)，並(bing)用(yong)無(wu)菌的(de)PBS溶液(ye)清(qing)洗2-3次，洗掉(diao)紅細(xi)胞和(he)死(si)細(xi)胞，加(jia)入(ru)10ml新鮮(xian)的(de)M199培養基(ji)。

8. 換培(pei)養基(ji)：

   a. 以後(hou)每(mei)2天換壹次培養基(ji)（每(mei)次換掉(diao)2/3的(de)培養基(ji)）。

9. 細(xi)胞生(sheng)長(chang)：

   a. 壹般培養5-7天(tian)，細(xi)胞可(ke)長(chang)滿至80-90%單(dan)層，這時可(ke)以進行傳(chuan)代。

10. 傳(chuan)代：

    a. 倒掉(diao)培(pei)養基(ji)，用(yong)無(wu)菌的(de)PBS溶液(ye)清(qing)洗2-3次，加入(ru)2-3ml消(xiao)化(hua)液(ye)（0.25%胰(yi)酶+0.1%EDTA）消(xiao)化(hua)細(xi)胞，在(zai)顯微(wei)鏡下觀(guan)察，壹旦(dan)細(xi)胞變圓，即(ji)加入(ru)2-3倍有(you)血(xue)清(qing)的(de)DMEM培養基(ji)終(zhong)止反應(ying)。

    b. 用彎管(guan)將細(xi)胞吹(chui)打(da)下來(lai)，並將所消(xiao)化(hua)的(de)細(xi)胞轉(zhuan)移(yi)到(dao)壹個(ge)50ml無(wu)菌離(li)心管(guan)中(zhong)，2000轉(zhuan)/分，離(li)心3分鐘。

    c. 倒掉(diao)上(shang)清(qing)，加入(ru)10ml新鮮(xian)培(pei)基(ji)，壹般壹瓶細(xi)胞可(ke)傳(chuan)代3-4瓶。以後(hou)照此(ci)傳(chuan)代培養。

11. 優(you)化培(pei)養：

    a. 壹般傳(chuan)代2-3代（培養了(le)20天(tian)左(zuo)右(you)）用(yong)於(yu)各(ge)種實(shi)驗(yan)效果(guo)較好。

以上(shang)是人(ren)臍(qi)靜(jing)脈內皮(pi)細(xi)胞（HUVEC）的(de)培養步(bu)驟(zhou)，希望對妳(ni)有(you)所幫助。