細胞外(wai)泌體(ti)數量的(de)計(ji)算(suan)方法

細(xi)胞外(wai)泌體(ti)（extracellular vesicles，EVs）是壹類(lei)由細胞(bao)釋放的(de)小(xiao)型膜(mo)泡，內(nei)含(han)有多種生物活性分(fen)子，如(ru)蛋(dan)白(bai)質、核酸(suan)和代謝物等。 EVs在細胞(bao)間(jian)傳(chuan)遞(di)信息和調節(jie)多種生物過(guo)程中起著重要(yao)作(zuo)用(yong)，因此引(yin)起了廣泛的(de)研(yan)究興趣(qu)。

在研(yan)究細胞(bao)外(wai)泌體(ti)時(shi)，壹個關鍵問題是如(ru)何準確計(ji)算(suan)收獲(huo)的(de)細(xi)胞外(wai)泌體(ti)數量。本(ben)文將(jiang)介紹壹種常(chang)用(yong)的(de)方(fang)法，可用(yong)於推(tui)算(suan)細胞(bao)外(wai)泌體(ti)的(de)數(shu)量。

假設(she)我們(men)有壹份300ml的(de)上(shang)清液(ye)樣品，目標是推(tui)算(suan)其中(zhong)細胞外(wai)泌體(ti)的(de)數(shu)量。可以通(tong)過(guo)以下步驟(zhou)進行(xing)：

1.我們(men)需要(yao)對上(shang)清液(ye)進行(xing)離心(xin)處理(li)，以沈(chen)澱(dian)出細胞外(wai)泌體(ti)。離心的(de)速(su)度和時(shi)間(jian)可(ke)以根據(ju)實(shi)驗需要(yao)進行(xing)優(you)化，壹般來(lai)說，1500-2000g的(de)離(li)心速(su)度，30分(fen)鐘的(de)離(li)心時(shi)間(jian)可(ke)以獲(huo)得較好的(de)沈(chen)澱(dian)效(xiao)果。

2.接下來，我們(men)需要(yao)重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞外(wai)泌體(ti)沈(chen)澱(dian)體(ti)，使用(yong)1ml的(de)PBS緩沖(chong)液(ye)進行(xing)重懸(xuan)。為了確(que)保充(chong)分(fen)分(fen)散，可(ke)使(shi)用(yong)超聲(sheng)波(bo)或輕(qing)輕振蕩(dang)的(de)方(fang)式進行(xing)混合(he)。

3.現(xian)在，我們(men)可(ke)以利用(yong)壹種常(chang)用(yong)的(de)推(tui)算(suan)方法來計算(suan)細胞(bao)外(wai)泌體(ti)的(de)數(shu)量。這種方(fang)法是通(tong)過(guo)測量(liang)細胞(bao)外(wai)泌體(ti)的(de)蛋(dan)白(bai)質含量(liang)，然後(hou)根據(ju)已(yi)知(zhi)的(de)細(xi)胞外(wai)泌體(ti)蛋白(bai)質含量(liang)來推(tui)算(suan)其數(shu)量。

4.使用(yong)蛋白(bai)質測量(liang)方法，如BCA或Bradford方法，測量每(mei)個標準(zhun)樣品的(de)蛋(dan)白(bai)質含量(liang)。將(jiang)測(ce)量(liang)結(jie)果(guo)記錄(lu)下來。

5.將(jiang)標準(zhun)樣品的(de)蛋(dan)白(bai)質含量(liang)與(yu)已(yi)知(zhi)數(shu)量(liang)的(de)細(xi)胞外(wai)泌體(ti)進行(xing)對比(bi)，建(jian)立(li)標準(zhun)曲線。可以使用(yong)非線性回(hui)歸分(fen)析(xi)來(lai)擬合(he)數據(ju)，確(que)定標準(zhun)曲線的(de)方(fang)程式。標準(zhun)曲線可以用(yong)於後(hou)續(xu)樣品的(de)泛(fan)定量。

6.用(yong)相(xiang)同的(de)蛋(dan)白(bai)質測量(liang)方法，測量待推(tui)算(suan)樣品（重(zhong)懸(xuan)後(hou)的(de)細(xi)胞外(wai)泌體(ti)懸(xuan)液(ye)）的(de)蛋(dan)白(bai)質含量(liang)。將(jiang)測(ce)量(liang)結(jie)果(guo)代入標準(zhun)曲線方程式中，計(ji)算(suan)細胞(bao)外(wai)泌體(ti)的(de)數(shu)量。

需要(yao)註意的(de)是，此(ci)方法僅提供(gong)細胞(bao)外(wai)泌體(ti)數量的(de)推(tui)算(suan)，結(jie)果(guo)可能(neng)存在(zai)壹定的(de)誤差。另(ling)外(wai)，外(wai)泌體(ti)的(de)大(da)小(xiao)和組(zu)成(cheng)可(ke)能(neng)在不同的(de)樣品之(zhi)間(jian)有所差異，因此標準(zhun)曲線的(de)準(zhun)確性需要(yao)在(zai)不同樣品中(zhong)進行(xing)驗證。

例如(ru)，如(ru)果我們(men)測(ce)得(de)重(zhong)懸(xuan)液(ye)的(de)蛋(dan)白(bai)質含量(liang)為2μg/mL，並(bing)且(qie)根據(ju)標準(zhun)曲線推(tui)算(suan)出每(mei)1μg蛋白(bai)質對應(ying)100萬個細胞外(wai)泌體(ti)。那麽(me)我們(men)可(ke)以推(tui)算(suan)出300ml的(de)上(shang)清液(ye)中細胞(bao)外(wai)泌體(ti)的(de)數(shu)量為6×10^8個(ge)（2μg/mL × 300ml × 100萬個/μg）。

綜上所述，推(tui)算(suan)細胞(bao)外(wai)泌體(ti)的(de)數(shu)量是基於測(ce)量(liang)重懸(xuan)液(ye)中的(de)蛋(dan)白(bai)質含量(liang)，並通(tong)過(guo)標準(zhun)曲線推(tui)算(suan)出細胞外(wai)泌體(ti)的(de)實(shi)際(ji)數量(liang)。這種方(fang)法簡單(dan)且(qie)經濟(ji)實(shi)用(yong)，適用(yong)於常(chang)規(gui)實(shi)驗室中(zhong)對細(xi)胞外(wai)泌體(ti)數量的(de)推(tui)算(suan)。然而，需要(yao)註意的(de)是，這(zhe)種方(fang)法僅能(neng)提供(gong)近似(si)數量(liang)，精確(que)的(de)細(xi)胞外(wai)泌體(ti)數量仍(reng)需通(tong)過(guo)更精細(xi)的(de)測(ce)量方法來得出。

當(dang)收集細胞(bao)外(wai)泌體(ti)體諒(liang)過(guo)少的(de)時(shi)候(hou)可(ke)以通(tong)過(guo)以下幾(ji)個方(fang)法解決：

1. 增(zeng)加細胞(bao)密(mi)度：可(ke)以嘗(chang)試在大皿中接(jie)種更多的(de)細(xi)胞，以增(zeng)加外(wai)泌體(ti)的(de)產(chan)量。但是需要(yao)註意，太(tai)高(gao)的(de)細(xi)胞密度可(ke)能(neng)會(hui)引(yin)起細胞過(guo)度增(zeng)殖(zhi)或(huo)細胞死(si)亡，因此需要(yao)找到壹個合(he)適(shi)的(de)平(ping)衡(heng)點。

2. 使用(yong)外(wai)泌體(ti)增(zeng)多的(de)培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian)：調(tiao)整(zheng)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)的(de)條(tiao)件(jian)，例如(ru)改(gai)變培(pei)養(yang)基的(de)成(cheng)分(fen)、優(you)化培(pei)養(yang)的(de)pH值(zhi)、溫(wen)度或(huo)氧(yang)氣(qi)濃度等(deng)，以促(cu)進外(wai)泌體(ti)的(de)釋(shi)放。

3. 使(shi)用(yong)細胞(bao)因子或化學(xue)物質刺激：有些(xie)細胞(bao)因子或化學(xue)物質可以刺激細(xi)胞(bao)釋放更多的(de)外(wai)泌體(ti)。妳(ni)可以嘗(chang)試添加適量(liang)的(de)這(zhe)些物質到培(pei)養(yang)基中，以提高(gao)外(wai)泌體(ti)的(de)產(chan)量。

4. 使用(yong)細胞(bao)工(gong)程技術(shu)：壹些細(xi)胞(bao)工程技術(shu)可(ke)以改(gai)變細(xi)胞(bao)的(de)代(dai)謝途徑(jing)或基因表達(da)，從(cong)而增(zeng)加外(wai)泌體(ti)的(de)產(chan)量。例如(ru)，通(tong)過(guo)過(guo)表達(da)某(mou)些(xie)關鍵基因可以增(zeng)加細胞(bao)產(chan)生外(wai)泌體(ti)的(de)能(neng)力。這(zhe)種方(fang)法可能(neng)需要(yao)更復雜(za)的(de)實(shi)驗步驟(zhou)和方案，但可以獲(huo)得更高(gao)的(de)外(wai)泌體(ti)產量。

   蘇(su)州阿爾法生物提供(gong)的(de)生物反應(ying)器(qi)、PCR儀、振蕩(dang)培養(yang)箱、離(li)心機、細(xi)胞(bao)計數(shu)儀、細胞分(fen)析(xi)儀(yi)、電泳儀(yi)、粒(li)徑(jing)分(fen)析(xi)儀(yi)、流式細胞(bao)儀等(deng)廣泛用(yong)於細(xi)胞(bao)外(wai)囊(nang)泡的(de)分(fen)離和表征(zheng)研究等。