PCR產(chan)物純(chun)化實驗步(bu)驟

PCR反(fan)應中目(mu)基因(yin)的(de)獲取實驗

壹(yi)、實驗目(mu)的(de)
掌握(wo)PCR反(fan)應的(de)基本原(yuan)理(li)與實驗技術。
二(er)、實驗原(yuan)理(li)
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合(he)酶鏈(lian)式(shi)反(fan)應，可(ke)以選擇(ze)性擴增(zeng)壹段(duan)DNA序列。其(qi)基(ji)本步(bu)驟(zhou)是，首(shou)先(xian)將待(dai)擴增(zeng)的(de)模板(ban)DNA變性使之成為單(dan)鏈，DNA樣(yang)品(pin)中(zhong)，特異性的(de)引物能(neng)夠(gou)與其(qi)互(hu)補(bu)的(de)序列雜交(jiao)，在(zai)dNTPs和(he)Taq酶存在(zai)時(shi)，就可(ke)以合(he)成模(mo)板(ban)DNA的(de)互補(bu)鏈，反(fan)應完成(cheng)後(hou)，將反(fan)應混合(he)物加熱(re)使DNA雙(shuang)鏈變(bian)性，溫度(du)下(xia)降(jiang)後，過量的(de)引物又(you)可(ke)以開始第(di)二輪(lun)的(de)合(he)成反(fan)應。這種延(yan)伸(shen)-變性-退火(huo)-延(yan)伸(shen)的(de)循環可(ke)以重復(fu)多次，使所(suo)需(xu)要的(de)DNA片(pian)段(duan)得(de)到特異性的(de)擴增(zeng)。
1. 變性(xing)：加熱(re)使模板DNA在(zai)高溫(wen)下(xia)（94℃）變(bian)性，雙(shuang)鏈間的(de)氫鍵斷(duan)裂(lie)而形(xing)成兩(liang)條單(dan)鏈.
2. 退(tui)火(huo)：使溶(rong)液(ye)溫度(du)降(jiang)至50～60℃，模板(ban)DNA與引物按(an)堿基(ji)配(pei)對(dui)原(yuan)則(ze)互補結(jie)合(he).
3. 延(yan)伸(shen)：溶(rong)液(ye)反(fan)應溫度(du)升至72℃，耐(nai)熱(re)DNA聚(ju)合(he)酶以(yi)單(dan)鏈DNA為模板(ban)，在(zai)引物的(de)引導(dao)下(xia)，利(li)用反(fan)應混合(he)物中(zhong)的(de)4種脫(tuo)氧(yang)核(he)苷(gan)三磷(lin)酸（dNTPs），按(an)5ˊ→3ˊ方(fang)向(xiang)復(fu)制出(chu)互補DNA。
上述3步為壹個循環，即高溫(wen)變性(xing)、低溫(wen)退(tui)火(huo)、中溫(wen)延(yan)伸(shen)3個階段(duan)。從(cong)理(li)論(lun)上講，每經過(guo)壹個循環，樣(yang)本中(zhong)的(de)DNA量應(ying)該(gai)增(zeng)加壹倍(bei)，新形(xing)成的(de)鏈又(you)可(ke)成為新壹(yi)輪循環的(de)模板(ban)，經過(guo)25～30個循環後(hou)DNA可(ke)擴增(zeng)106～109倍(bei)。
典型(xing)的(de)PCR反(fan)應體(ti)系(xi)由(you)如下(xia)組分(fen)組成：DNA模板(ban)、反(fan)應緩沖液(ye)、dNTPs、MgCl2、兩(liang)個合(he)成的(de)DNA引物、耐(nai)熱(re)Taq聚(ju)合(he)酶。
三(san)、 試(shi)劑(ji)和(he)緩沖液(ye)
PCR mix，10×PCR Buffer，引物，模(mo)板(ban)。
四、 儀器(qi)耗材
PCR儀，掌上(shang)離心機(ji)，微量移液(ye)器(qi)，槍(qiang)頭(tou)，1.5mL離(li)心管，PCR管，冰(bing)盒。
五(wu)、 實驗步(bu)驟（每人壹組，每人做1管(guan)，純(chun)化時(shi)兩(liang)人壹組）
1. 查(zha)找基(ji)因(yin)序列，設計(ji)合(he)成PCR引物。註(zhu)意(yi)合(he)成引物約(yue)需(xu)壹周(zhou)時間，請(qing)提前準(zhun)備。詳細步(bu)驟(zhou)請參考實驗壹(yi)後面(mian)的(de)附件(jian)內(nei)容。
2. 在(zai)50μL反(fan)應體(ti)系(xi)中(zhong)，加入：
模(mo)板DNA (5ng/μL)        1   
引物P1P2 (10μmol/L)    各(ge)1   
2×PCR mix              25 
ddH2O                  22 
在(zai)冰(bing)上(shang)配(pei)制，註(zhu)意(yi)混(hun)勻後(hou)離心。加入10μL石(shi)蠟油覆(fu)蓋(gai)。
3. 在(zai)PCR儀中(zhong)預(yu)變性94℃ 4min，然(ran)後循環：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，30個循環；循環結(jie)束(shu)後(hou)，72℃10min 。擴增(zeng)的(de)PCR產(chan)物4℃保(bao)存。（OC-II）
4. 取PCR產(chan)物2-5μL與上樣(yang)緩沖液(ye)混合(he)，點樣(yang)。
5. 1% 瓊(qiong)脂(zhi)糖膠(jiao)電(dian)泳，160V 30-40min。
6. 電(dian)泳結(jie)束(shu)，溴(xiu)化乙(yi)錠(ding)染(ran)色(se)5-10分(fen)鐘。
7. 用凝(ning)膠成(cheng)像(xiang)儀觀察、拍(pai)照(zhao)。
8. PCR產(chan)物切(qie)膠(jiao)回(hui)收(shou)。步驟參(can)見(jian)膠(jiao)回(hui)收(shou)Kit說(shuo)明書。
A 酶切(qie)片(pian)段(duan)的(de)純(chun)化及(ji)其(qi)回(hui)收(shou)
使用切(qie)膠回(hui)收(shou)kit進行(xing)PCR產(chan)物的(de)回(hui)收(shou)。具(ju)體(ti)操(cao)作(zuo)步(bu)驟如下(xia)，詳見(jian)說(shuo)明書。
1）稱回(hui)收(shou)的(de)膠，每0.1g加100µL XP2 ；
2）55度(du)5-7分(fen)鐘至溶(rong)膠(jiao) ；
3）取溶(rong)膠(jiao)液(ye)加入回(hui)收(shou)柱子(zi)，最大體(ti)積(ji)700µL；10000g, 1min；
4) 加300µl XP2 ，10000g 1min；
5）加700µl SPW ，10000g 1min；
6）重復(fu)5）；
7）空(kong)管離(li)心2min，13000 g
8）幹燥，加15-30µL  Eulation Buffer
9）13000 g，1min
 
DNA產(chan)物純(chun)化kit，操(cao)作(zuo)步(bu)驟：
將PCR反(fan)應液(ye)（40ul）或酶(mei)促(cu)反(fan)應液(ye)移至壹幹(gan)凈(jing)的(de)1.5ml離心管中，加入5倍(bei)體(ti)積(ji)的(de)buffer3，充分(fen)混勻。（用前(qian)確定(ding)加入適(shi)量(liang)的(de)異丙(bing)醇(chun)）
將混(hun)合(he)液(ye)全部(bu)移入(ru)吸(xi)附柱(zhu)，8000g離(li)心30s；將濾出(chu)液(ye)再次加入到吸(xi)附柱(zhu)中(zhong)再次過柱(zhu)，8000g離(li)心30s（此(ci)步(bu)驟(zhou)可(ke)以提高回(hui)收(shou)效率）；倒(dao)掉收(shou)集(ji)管(guan)中(zhong)的(de)液(ye)體(ti)，將(jiang)吸(xi)附柱(zhu)放入同壹收(shou)集(ji)管(guan)中(zhong)。
向(xiang)吸(xi)附柱(zhu)中(zhong)加入500ul Wash Solution（加到壁(bi)上），9000g離(li)心30s。倒(dao)掉收(shou)集(ji)管(guan)中(zhong)的(de)液(ye)體(ti)，將(jiang)吸(xi)附柱(zhu)放入同壹收(shou)集(ji)管(guan)中(zhong)。（Wash Solution使用前(qian)請檢查(zha)是否已加入正(zheng)確量(liang)的(de)無水乙(yi)醇(chun)）
重復(fu)步(bu)驟(zhou)3壹次
將空(kong)吸(xi)附柱(zhu)和(he)收(shou)集(ji)管(guan)放入離心機(ji)，9000g離心1min。下(xia)管(guan)扔掉，上(shang)管(guan)放入1.5ml離心管中，晾幹(gan)。（殘(can)余(yu)的(de)乙(yi)醇(chun)會嚴重(zhong)影響得(de)率和(he)後續試(shi)驗）
在(zai)吸(xi)附膜(mo)中央(yang)加入25ul 60℃提前預(yu)熱(re)（進壹步提高得(de)率）的(de)Elution Buffer（加到濾芯(xin)上(shang)），室(shi)溫(wen)靜置(zhi)1min，9000g離(li)心1min。將所(suo)得(de)到的(de)DNA溶(rong)液(ye)置於(yu)-20℃保存或用於(yu)後續試(shi)驗。註(zhu)意：本步(bu)驟(zhou)中，所(suo)有(you)轉速單(dan)位為g。
B 乙(yi)醇(chun)沈澱(dian)法
也可(ke)以使用乙(yi)醇(chun)沈澱(dian)法對(dui)PCR產(chan)物回(hui)收(shou)。具(ju)體(ti)操(cao)作(zuo)步(bu)驟如下(xia)。
加入等(deng)體(ti)積(ji)的(de)冰(bing)無水乙(yi)醇(chun)，加入1/10體(ti)積(ji)的(de)KAc（3M  pH5.2）。
上下(xia)顛(dian)倒(dao)混勻，-20℃30min；12000r/min 4℃ 10min。
棄上(shang)清，加入70%的(de)冰(bing)乙(yi)醇(chun)，輕輕混勻。12000r/min 4℃離(li)心10min。
棄上(shang)清，室溫(wen)幹燥，至無乙(yi)醇(chun)。
加入適(shi)量(liang)體(ti)積(ji)的(de)ddH2O。六(liu)、註(zhu)意事(shi)項
1. 進行(xing)PCR反(fan)應時，註(zhu)意(yi)加入試(shi)劑的(de)順(shun)序。註意加入任(ren)何壹種試劑後均需混(hun)勻。
2. 本實驗使用2xPCR mix，包(bao)含(han)有dNTPs和(he)Taq酶。
3. 引物的(de)稀釋(shi)：分(fen)子(zi)量24bp*324.5 = 7788，質量(liang)數10OD*33 ＝33ug，摩爾(er)數=33/7788 =4.2 nmol，母液(ye)濃(nong)度(du)4.2 n mol / 84μL H2O = 50μmol/L，使用時(shi)取母液(ye)稀釋(shi)5倍(bei)，則終(zhong)濃(nong)度(du)為10μmol/L。
4. PCR擴增(zeng)產(chan)物共(gong)20μL，其(qi)中(zhong)2-5 μL用於(yu)檢測(ce)，剩(sheng)余(yu)的(de)用於(yu)純(chun)化回(hui)收(shou)。具(ju)體(ti)步(bu)驟(zhou)參考 實驗二(er)C內(nei)容。
5. 使用自(zi)己的(de)實驗材料(liao)進行(xing)PCR擴增(zeng)的(de)學生(sheng)，請(qing)提前準(zhun)備引物和(he)模板(ban)，並(bing)與任課教師(shi)協商(shang)。
思(si)考(kao)題：
影響PCR反(fan)應特異性的(de)因(yin)素有哪(na)些？請分(fen)析原(yuan)因(yin)及(ji)解決(jue)辦法。
PCR引物設(she)計(ji)的(de)原(yuan)則(ze)有哪些？請設(she)計本實驗的(de)PCR引物，並(bing)寫(xie)到實驗論(lun)文中。 
附1：基(ji)因(yin)序列查(zha)找和(he)PCR引物設(she)計(ji)
實驗課進行(xing)之(zhi)前(qian)，需(xu)要利(li)用NCBI查(zha)找基(ji)因(yin)序列，並(bing)設(she)計(ji)PCR引物。

進入NCBI 後，在(zai)Search的(de)下(xia)拉框(kuang)中(zhong)選(xuan)擇(ze)Nucleotide，再輸(shu)入(ru)基因(yin)名稱(cheng)，點擊Search即可(ke)。也可(ke)輸入具(ju)體(ti)的(de)物種(zhong)名以(yi)縮(suo)小(xiao)範(fan)圍(wei)，獲(huo)得(de)cDNA 序列信息。例如：水稻半(ban)胱(guang)氨酸蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑基(ji)因(yin)（Oryzacystatin, OC）序列信息

OC-II, Os05g41460, 456bp
ATGCGGGCATCATCTCTCTTCGCGGAATCGGTGTTCACTACATCTGCTGCTGCTGGTCGTCGTCGTTGTCCTCGTCTCGCCGCCGTTCCCGTTACCCTCTTCTTCTCCACCGGTCGCGGCTCGCCGGCGATGGCCGAGGAGGCGCAGCAGCCACGCGGCGTGAAGGTGGGCGGCATCCACGACGCGCCGGCCGGGCGCGAGAACGACCTCACCACCGTCGAGCTCGCCCGGTTCGCCGTCGCCGAGCACAACAGCAAGGCCAACGCGATGTTGGAGTTGGAGAGGGTGGTGAAGGTGAGGCAGCAGGTGGTGGGCGGGTTCATGCACTACCTCACCGTCGAGGTGAAGGAACCCGGCGGCGCCAATAAGCTGTACGAGGCCAAGGTGTGGGAGAGGGCGTGGGAGAACTTCAAGCAGCTCCAGGATTTCAAGCCCCTCGACGACGCCACCGCCTAA
引物設(she)計(ji)。要求擴增(zeng)上述(shu)完整的(de)cDNA 序列，並(bing)在(zai)兩(liang)端添(tian)加酶切(qie)位點，5‘添(tian)加EcoRI（GAATTC）， 3‘端添(tian)加HindIII （AAGCTT）。以便(bian)克隆(long)到pET30a的(de)相應(ying)位點。註(zhu)意(yi)PCR產(chan)物中(zhong)沒(mei)有上(shang)述酶切位點，否則不能(neng)使用。
prim-OC2-R   GCAAGCTTTTAGGCGGTGGCGTCGTC    26bp  下(xia)劃(hua)線為EcoRI識別(bie)序列
#prim-OC2-F   GCGAATTCATGCGGGCATCATCTCTC    26bp  下(xia)劃(hua)線為HindIII 識別(bie)序列
 
T載體(ti)通(tong)用引物
B0012 (M13-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
B0014 (M13-48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA