熒光(guang)定量(liang)PCR的優化(hua)方法(fa)

使(shi)用(yong)熒(ying)光定量(liang)PCR儀(yi)進行(xing)定量(liang)PCR實驗(yan)時(shi)，通(tong)常出(chu)現(xian)效(xiao)果(guo)不(bu)佳的情(qing)況(kuang)，下面(mian)小編(bian)就(jiu)帶(dai)妳了解(jie)壹(yi)些(xie)的PCR實驗(yan)的優化(hua)方法(fa)：

壹(yi)、基本參(can)數(shu)的優化(hua)

1.1 MgCl2的濃度(du)　在(zai)PCR反應中，MgCl2的濃度(du)對(dui)影(ying)響(xiang)酶(mei)的活(huo)性(xing)是至關(guan)重(zhong)要的，不(bu)僅(jin)如(ru)此(ci)，合(he)適的MgCl2的濃度(du)還能(neng)在(zai)反應中得(de)到(dao)較(jiao)低(di)的Cp(crossing point)值，較高的熒光信(xin)號(hao)強度(du)以(yi)及(ji)良(liang)好(hao)的曲線峰值。所(suo)以(yi)對(dui)其(qi)的深(shen)度(du)選擇(ze)應慎重(zhong)

壹(yi)般(ban)來說，對以(yi)DNA或cDNA為(wei)模板(ban)的PCR反應，應選擇(ze)2－5 mM濃度(du)的MgCl2，對以(yi)mRNA為(wei)模板(ban)的RT－PCR而言，則應選擇(ze)的濃度(du)為(wei)4－8 mM。

1.2 模板(ban)的濃度(du)：如(ru)果(guo)研究(jiu)者是進行(xing)實(shi)驗(yan)，那(na)麽(me)應選(xuan)擇(ze)壹(yi)系列(lie)稀(xi)釋濃度(du)的模板(ban)來進行(xing)實(shi)驗(yan)，以(yi)選(xuan)擇(ze)出最(zui)為(wei)合(he)適的模板(ban)濃度(du)，如(ru)果(guo)條件(jian)困難(nan)，也(ye)至少(shao)要選(xuan)擇(ze)兩(liang)個(ge)稀釋度(du)（高和中、低濃度(du)）來進行(xing)實(shi)驗(yan)。

壹(yi)般(ban)而(er)言，使Cp位於15－30個(ge)循環比較(jiao)合(he)適，若大(da)於(yu)30則應使用(yong)較(jiao)高的模板(ban)濃度(du)，如(ru)果(guo)Cp小於15則應選擇(ze)較低的模板(ban)深(shen)度(du)。對於Cp值的確定，經驗(yan)上(shang)是SYBR Green I探針(zhen)的熒光信(xin)號(hao)比本底(di)高2倍，雜(za)交(jiao)探(tan)針的熒光強(qiang)度(du)比(bi)本底(di)高0.3倍。

二(er)、使用(yong)SYBR Green I測定DNA時的條件(jian)優化(hua)

2.1 MgCl2的濃度(du)：大(da)多數(shu)引(yin)物(wu)－模板(ban)對(dui)其(qi)的要求是2－4 mM。

2.2 模板(ban)的濃度(du)：初(chu)次(ci)實(shi)驗(yan)要(yao)求做壹(yi)系列(lie)的稀釋濃度(du)，如(ru)條(tiao)件(jian)限制(zhi)，至(zhi)少(shao)完成(cheng)兩(liang)個(ge)稀釋的度的測定。基因組(zu)DNA在(zai)50 ng-5 pg之間(jian)選(xuan)擇(ze)，質粒DNA在(zai)106拷(kao)貝(bei)數(shu)左(zuo)右選擇(ze)。

2.3 PCR抑制(zhi)子(zi)：通(tong)常用(yong)於(yu)消除(chu)抑制(zhi)子(zi)的辦法(fa)是將樣(yang)本進(jin)行(xing)稀(xi)釋，但是在(zai)某(mou)些(xie)條(tiao)件(jian)下，抑制(zhi)子(zi)的濃度(du)高，而模板(ban)量(liang)少(shao)，稀釋法(fa)就不(bu)再(zai)能達(da)到(dao)好(hao)的效(xiao)果(guo)，反會(hui)使(shi)反應的敏(min)感(gan)度(du)降(jiang)低(di)，所(suo)以(yi)，研究(jiu)者若要(yao)進(jin)行(xing)實(shi)時(shi)定量(liang)PCR研究(jiu)，最(zui)好(hao)選(xuan)用(yong)純化(hua)的模板(ban)。

2.4 引(yin)物(wu)的濃度(du)：引(yin)物(wu)的濃度(du)是壹(yi)個(ge)影響(xiang)PCR反應的關(guan)鍵因(yin)素，其(qi)濃度(du)太(tai)低(di)，會(hui)致(zhi)使(shi)反應不(bu)完，若引(yin)物(wu)太多，則發生錯(cuo)配以(yi)及(ji)產生非(fei)特(te)異(yi)的產物(wu)的可能(neng)性(xing)會(hui)大(da)大(da)增(zeng)加。對(dui)於(yu)大(da)多數(shu)PCR反應，0.5 uM是個(ge)合(he)適的濃度(du)，若初(chu)次(ci)選(xuan)用(yong)這個(ge)濃度(du)不(bu)理想，可在(zai)0.3－1.0 uM之間(jian)進(jin)行(xing)選(xuan)擇(ze)，直至達(da)到(dao)滿意(yi)的結果。

2.6 退(tui)火(huo)溫度：實驗(yan)設置的退(tui)火(huo)溫度應比計算得(de)出(chu)的Tm值小5 ℃，然(ran)後(hou)在(zai)1－2 ℃內進(jin)行(xing)選(xuan)擇(ze)。壹(yi)般(ban)地，退(tui)火(huo)溫度要根據(ju)經驗(yan)來確定，這個(ge)經驗(yan)值(zhi)往(wang)往(wang)會(hui)同(tong)計(ji)算得(de)到(dao)的Tm值有較(jiao)大(da)的差距(ju)。

三(san)、用(yong)SYBR Green I進(jin)行(xing)壹(yi)步(bu)法(fa)RT－PCR的條件(jian)優化(hua)

3.1 MgCl2的濃度(du)：不(bu)同的靶分(fen)子(zi)選(xuan)用(yong)不(bu)同的濃度(du)，通(tong)常是在(zai)4－8 mM之間(jian)選(xuan)擇(ze)。

3.2 模板(ban)的濃度(du)：RT－PCR實(shi)驗(yan)既可以(yi)選(xuan)用(yong)總RNA，又可以(yi)選(xuan)用(yong)mRNA，其(qi)濃度(du)應(ying)在(zai)1 pg-1 ug之間(jian)選(xuan)擇(ze)。對於低(di)模板(ban)濃度(du)，可以(yi)增(zeng)加適量(liang)的MS2或用(yong)alternative RNA 作(zuo)為(wei)載(zai)體進行(xing)測定。

3.3 對照設置：每壹(yi)引(yin)物(wu)都應設有陰(yin)性(xing)對(dui)照，陽性(xing)對(dui)照和汙染對照。

四(si)、雜(za)交(jiao)探(tan)針測定DNA

4.1 MgCl2的濃度(du)：在(zai)2－4 mM的基礎(chu)上加0.5－1.0 mM，但是不(bu)要超(chao)過2.0 mM。

4.2 雜交(jiao)探(tan)針的濃度(du)：初(chu)次(ci)實(shi)驗(yan)每(mei)個(ge)探針用(yong)0.2 uM，如(ru)果信號(hao)強度(du)達(da)不(bu)到要(yao)求，可以(yi)增(zeng)加至(zhi)0.4 uM。

4.3 對(dui)照設置：每壹(yi)引(yin)物(wu)都要設陰(yin)性(xing)對(dui)照，每壹(yi)探針(zhen)都要設陰(yin)性(xing)對(dui)照。每次(ci)實(shi)驗(yan)都要設陽性(xing)對(dui)照。

4.4 其(qi)它(ta)的條件(jian)同(tong)SYBR Green I。

五(wu)、用(yong)雜(za)交(jiao)探(tan)針實(shi)時(shi)定量(liang)RT－PCR

5.1 MgCl2的濃度(du)：在(zai)4－8 mM之間(jian)進(jin)行(xing)選(xuan)擇(ze)。

5.2 雜交(jiao)探(tan)針的濃度(du)：初(chu)實驗(yan)用(yong)0.2 uM，如(ru)果熒光信(xin)號(hao)強度(du)不(bu)足，可以(yi)增(zeng)加至(zhi)0.4 uM。

5.3 模板(ban)濃度(du)設置：優化(hua)的擴(kuo)增(zeng)須(xu)進(jin)行(xing)壹(yi)系列(lie)知釋度(du)的實驗(yan)，在(zai)條(tiao)件(jian)有(you)困難(nan)的條件(jian)下，至少(shao)要進(jin)行(xing)兩(liang)個(ge)稀釋度(du)的測定。選用(yong)1 pg-1 ug的總RNA或是mRNA，若是模板(ban)的濃度(du)過小（小於10 ng/ul）,則可加入(ru)MS2或alternative RNA作(zuo)為(wei)載(zai)體。

5.4 對照(zhao)設置：每個(ge)引(yin)物(wu)都要設無模板(ban)對(dui)照，陽性(xing)對(dui)照以(yi)及(ji)汙染對照。

六、關(guan)於雜(za)交(jiao)探(tan)針的評價(jia)

在(zai)使(shi)用(yong)雜(za)交(jiao)探(tan)針進(jin)行(xing)實(shi)驗(yan)時(shi)，必(bi)須(xu)註(zhu)意(yi)防(fang)止探針(zhen)－引(yin)物(wu)二(er)聚體的形成和其(qi)本身(shen)在(zai)反應過程(cheng)中(zhong)的延伸。引(yin)物(wu)－探針(zhen)二(er)聚體的形成，主要(yao)是因為(wei)探針可與(yu)引(yin)物(wu)的3’末端雜(za)交(jiao)，其(qi)形成以(yi)後(hou)，會(hui)致(zhi)使(shi)此(ci)二(er)聚體擴(kuo)增(zeng)，從(cong)而(er)同(tong)目(mu)的基因競(jing)爭(zheng)反應的原(yuan)料，致(zhi)反應的效(xiao)率(lv)下降(jiang)。

探(tan)針(zhen)其(qi)本身(shen)能(neng)同目(mu)的基因相結合(he)，且(qie)其(qi)解(jie)鏈溫度(du)高於引(yin)物(wu)，所以(yi)它(ta)可能(neng)作為(wei)引(yin)物(wu)而引(yin)發(fa)延伸反應，為(wei)了防(fang)止發生(sheng)這種現(xian)象(xiang)，通(tong)常是將其(qi)3’末端全(quan)磷(lin)酸化(hua)，使之不(bu)能延(yan)伸，若此(ci)磷(lin)酸化(hua)不(bu)全(quan)或是沒有(you)磷(lin)酸化(hua)，就會(hui)產生目(mu)的基因的副產品(pin)，從而幹擾實驗(yan)結果。鑒(jian)於(yu)以(yi)上(shang)這兩(liang)點(dian)，所以(yi)應(ying)對(dui)探(tan)針(zhen)精心設計，並將(jiang)其(qi)末端全(quan)磷(lin)酸化(hua)。