免疫(yi)組化(hua)實驗(yan)步驟及常見問題(ti)分析

免疫(yi)組化(hua)實驗(yan)步驟及常見問題(ti)分析

免疫(yi)組化(hua)實驗(yan)流程
 
1.樣(yang)品(pin)制(zhi)備(bei)
 
2.組織固定(ding)：根據(ju)要求(qiu)收(shou)集人(ren)或動(dong)物(wu)的(de)組織用於(yu)IHC分(fen)析(xi)，沖(chong)洗(xi)並用固(gu)定(ding)劑(ji)（壹般(ban)用甲(jia)醛）進(jin)行固(gu)定(ding)
 
3.組織包(bao)埋(mai)：將(jiang)經(jing)甲(jia)醛固(gu)定的組織嵌(qian)入石蠟(la)，以(yi)長期(qi)保持其(qi)天(tian)然形狀(zhuang)和組織結構
 
4.切(qie)片安裝：將組織樣品(pin)在切(qie)片機上(shang)切(qie)片，並轉移(yi)至載玻片上(shang)幹(gan)燥(zao)保持其(qi)形(xing)態
 
5.脫蠟(la)水(shui)化(hua)：因切(qie)片上(shang)的石(shi)蠟(la)會(hui)妨礙染(ran)色，所以需(xu)將切(qie)片上(shang)的石(shi)蠟(la)溶(rong)出，並水(shui)化(hua)。脫蠟(la)或(huo)水(shui)化(hua)不(bu)全(quan)容(rong)易造(zao)成(cheng)非(fei)特異性(xing)背景(jing)著色（壹般(ban)的(de)脫蠟(la)水(shui)化(hua)步驟是(shi)：將(jiang)切(qie)片依次浸入二甲(jia)苯Ⅰ10min-二(er)甲(jia)苯Ⅱ10min-無(wu)水(shui)乙(yi)醇5min-95%無水(shui)乙(yi)醇5min-90%無水(shui)乙(yi)醇5min-80%無水(shui)乙(yi)醇5min-70%無水(shui)乙(yi)醇5min-50%無水(shui)乙(yi)醇5min-蒸餾(liu)水(shui)5min×3，進(jin)行脫蠟(la)水(shui)化(hua)）。
 
6.抗原(yuan)修復(fu)：由(you)於(yu)組織在甲(jia)醛固(gu)定過(guo)程(cheng)中(zhong)，蛋白之(zhi)間(jian)發(fa)生了交(jiao)聯及醛(quan)基(ji)的(de)封閉從而掩(yan)蓋(gai)抗原(yuan)決定(ding)簇(cu)。可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)高(gao)壓(ya)加(jia)熱修(xiu)復(fu)抗原(yuan)，使細胞內(nei)抗原(yuan)決定(ding)族(zu)暴(bao)露，從而提(ti)高抗原(yuan)檢(jian)測(ce)率。
 
7.非特(te)定(ding)位點(dian)封(feng)閉：為(wei)了防止壹抗的非特(te)異(yi)性(xing)結合(he)造(zao)成(cheng)假(jia)陽(yang)性(xing)，可(ke)以(yi)選(xuan)用BSA、羊(yang)血清等(deng)封(feng)閉非特異(yi)性(xing)結合(he)位點(dian)。封(feng)閉血清來(lai)源壹般(ban)與(yu)二抗保持壹致(zhi)，室(shi)溫封(feng)閉10-30min。
 
8.樣品(pin)染(ran)色
 
壹抗、二抗孵育(yu)：抗體孵育(yu)時間(jian)、溫度(du)及(ji)濃(nong)度(du)等(deng)因素對染(ran)色結果都(dou)存在很(hen)大(da)影響(xiang)。在4℃下(xia)反應(ying)緩慢(man)，背景(jing)較淺(qian)；37℃反應(ying)較快(kuai)時間(jian)較短；而室(shi)溫介(jie)於(yu)兩(liang)者之間(jian)，選擇(ze)室(shi)溫有(you)利於(yu)實驗(yan)的進行。二(er)抗壹般(ban)室(shi)溫孵育(yu)30min。
 
底物(wu)顯(xian)色：基(ji)於(yu)與(yu)酶綴(zhui)合(he)的(de)二(er)抗，抗原(yuan)通(tong)過(guo)生色或熒光方式(shi)直接檢(jian)測(ce)。
 
復(fu)染(ran)封(feng)片：組化(hua)染(ran)色後進行復(fu)染(ran)可(ke)以(yi)襯(chen)托(tuo)出(chu)組織形態結構，常用的(de)復(fu)染(ran)劑(ji)有(you)蘇(su)木精(jing)、曙(shu)紅(hong)、甲(jia)基(ji)綠(lv)、DAPI和(he)Hoechst熒光染(ran)色。觀(guan)察(cha)結束後(hou)使用中(zhong)性(xing)樹膠進(jin)行封(feng)片，可(ke)以(yi)長久保存。
 

免疫(yi)組化(hua)實驗(yan)常見問題(ti)分析

 
 
1. IHC實(shi)驗(yan)結果顯(xian)色過(guo)深(shen)
 
壹抗濃(nong)度(du)過(guo)高(gao)或(huo)孵育(yu)時間(jian)過(guo)長——降(jiang)低壹抗濃(nong)度(du)或(huo)減少(shao)孵育(yu)時間(jian)
 
孵育(yu)溫度(du)過(guo)高(gao)——選(xuan)擇(ze)4℃或(huo)室(shi)溫孵育(yu)
 
2. 實驗(yan)結果存在非(fei)特異性(xing)顯(xian)色
 
石蠟(la)切(qie)片脫蠟(la)不(bu)夠(gou)——延(yan)長脫蠟(la)時(shi)間(jian)
 
蛋白(bai)封閉不(bu)充(chong)分(fen)——增(zeng)加蛋(dan)白(bai)封(feng)閉時間(jian)
 
組織富含內源性(xing)生物(wu)素(su)與(yu)過(guo)氧化(hua)物(wu)酶(mei)——使用相(xiang)關試(shi)劑進(jin)行封(feng)閉
 
3. 實驗結果顯(xian)色弱或無(wu)染(ran)色
 
壹抗濃(nong)度(du)過(guo)低或孵育(yu)時間(jian)過(guo)短——增(zeng)加壹抗濃(nong)度(du)或(huo)延(yan)長孵育(yu)時間(jian)
 
組織中(zhong)無目(mu)的抗原(yuan)的表(biao)達(da)：壹抗種屬(shu)來(lai)源與(yu)二抗不(bu)匹配(pei)
 
免疫(yi)組化(hua)實驗(yan)註意事(shi)項(xiang)
 
切(qie)片脫蠟(la)和(he)水(shui)化(hua)要充(chong)分，加反應(ying)液時(shi)要覆蓋組織充分(fen)；每(mei)次加液前甩幹(gan)洗(xi)滌液(ye)，同時(shi)防止幹(gan)片。
 
壹抗的沖(chong)洗(xi)原(yuan)則：單獨沖(chong)洗(xi)，防交(jiao)叉反應(ying)汙(wu)染(ran)；溫(wen)柔(rou)沖(chong)洗(xi)，防止切(qie)片脫落；可(ke)采(cai)用浸洗(xi)方式(shi)。
 

有(you)條件(jian)的話立即拍照(zhao)，若(ruo)不(bu)能(neng)及(ji)時拍照(zhao)，也(ye)要(yao)封(feng)好片和用指(zhi)甲(jia)油(you)封固(gu)，保持避(bi)光和濕(shi)度(du)。

更(geng)多(duo)蛋(dan)白免疫(yi)印(yin)跡實(shi)驗設備(bei)、生物(wu)試(shi)劑(ji)等問題(ti)進入蘇(su)州(zhou)阿(e)爾法(fa)生物(wu)實(shi)驗(yan)器材有(you)限公(gong)司(si)進(jin)行了(le)解(jie)。