臍帶(dai)間(jian)充質(zhi)幹細(xi)胞(bao)分離(li)實(shi)驗

 臍(qi)帶(dai)間(jian)充質(zhi)幹細(xi)胞(bao)（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）是指存在(zai)於(yu)新生(sheng)兒臍帶組織中(zhong)的(de)壹種(zhong)多功能(neng)幹細(xi)胞(bao)，廣泛應用於(yu)組織工(gong)程(cheng)，細(xi)胞治療和基因(yin)治療。 HyCyte®臍(qi)帶間(jian)充質(zhi)幹細(xi)胞(bao)取自滿月(yue)自(zi)然(ran)分娩(mian)的(de)胎(tai)兒臍帶，傳(chuan)代擴增至第(di)二(er)代凍存(cun)。本產品(pin)經(jing)生物(wu)安全檢測，無(wu)細(xi)菌、真(zhen)菌、黴(mei)菌、支原(yuan)體和病毒汙染(ran)，表(biao)達(da)多種(zhong)人源(yuan)間(jian)質(zhi)幹細(xi)胞(bao)特(te)異性標記(ji)，具有(you)良好(hao)的(de)增(zeng)殖(zhi)和分化(hua)潛能(neng)，可分化(hua)為成(cheng)骨(gu)細(xi)胞(bao)、脂肪(fang)細(xi)胞、軟(ruan)骨(gu)細(xi)胞(bao)等。

壹、實(shi)驗目的(de)

  驗證HyCyte®人臍帶(dai)間(jian)充質(zhi)幹細(xi)胞(bao)培(pei)養基對(dui)於(yu)人臍帶(dai)華(hua)通(tong)質(zhi)膠中(zhong)提取間(jian)質(zhi)幹細(xi)胞(bao)培(pei)養的(de)能(neng)力。人體臍(qi)帶橫(heng)截(jie)面示(shi)意圖，臍帶(dai)內(nei)層(ceng)覆蓋(gai)，外(wai)層為(wei)臍上(shang)皮，三(san)個(ge)臍血管(guan)嵌(qian)在(zai)華(hua)通(tong)質(zhi)膠中(zhong)。華(hua)通(tong)質(zhi)膠是壹種(zhong)凝(ning)膠狀結(jie)締(di)組織，由富(fu)含(han)糖(tang)胺(an)聚糖(tang)（主(zhu)要(yao)是透(tou)明質(zhi)酸(suan)）、膠原(yuan)纖維(wei)和肌成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)以及(ji)偶(ou)爾(er)存(cun)在(zai)的(de)肥(fei)大細(xi)胞(bao)的(de)細(xi)胞外基質(zhi)組成。華(hua)通(tong)質(zhi)膠基質(zhi)細(xi)胞(bao)在(zai)血管(guan)周(zhou)圍(wei)附(fu)近最為豐(feng)富(fu)，在(zai)血管(guan)間(jian)華(hua)通(tong)質(zhi)膠中(zhong)變少。

二(er)、實(shi)驗試(shi)劑(ji)和實(shi)驗耗材

試(shi)劑(ji)：人臍帶(dai)間(jian)充質(zhi)幹細(xi)胞(bao)培(pei)養基（Cat.No.: UCHX-G101）

間(jian)充質(zhi)幹細(xi)胞(bao) 其他配套試(shi)劑(ji)均為(wei)HyCyte

耗材：T175培(pei)養瓶

三(san)、實(shi)驗步(bu)驟

(1)用無(wu)菌輔料(liao)鑷(nie)從轉(zhuan)運(yun)瓶中(zhong)取出(chu)臍帶，置於(yu)1×PBS培(pei)養皿中(zhong)。

(2)清洗(xi)臍帶(dai)，轉(zhuan)移(yi)至另(ling)壹1×PBS培(pei)養皿中(zhong)，重復(fu) 3次。

(3)將(jiang)臍(qi)帶剪成4 cm左(zuo)右小段，再(zai)清(qing)洗(xi)3次。

(4)去臍帶(dai)血(xue)管(guan)、羊(yang)膜，取華(hua)通(tong)膠。

(5)華(hua)通(tong)膠轉(zhuan)移(yi)至1個(ge)50 ml離心管(guan)中(zhong)，剪碎至(zhi)糜狀。

(6)T175瓶(ping)中(zhong)加(jia)入40 ml人臍帶(dai)幹細(xi)胞(bao)培(pei)養基。

(7)按(an)每(mei)個(ge)T175瓶1 ml組織接種(zhong)。混勻(yun)，靜置培(pei)養。

(8)靜置培(pei)養5 d以上(shang)，觀察(cha)貼壁克(ke)隆少(shao)，繼(ji)續(xu)培(pei)養。

(9)培(pei)養7 d後，觀察(cha)貼壁克(ke)隆多，加(jia)培(pei)養基培(pei)養。

(10)培(pei)養9 d後，克(ke)隆已(yi)有(you)較(jiao)大規模(mo)增殖(zhi)，繼(ji)續(xu)培(pei)養。

(11)培(pei)養第(di)10天，按1:1傳(chuan)代於(yu)新 T175瓶(ping)。同(tong)時(shi)，組織轉(zhuan)移(yi)至新(xin)T175瓶(ping)進行二(er)次遷(qian)移(yi)。

實(shi)驗總(zong)結(jie)

   本(ben)次實(shi)驗歷時(shi)18天，成功分離(li)培(pei)養人臍帶(dai)間(jian)質(zhi)幹細(xi)胞(bao)。臍帶組織塊貼(tie)壁正常（通常臍帶(dai)組織貼壁形成克隆時(shi)間(jian)在(zai)5-10天）。觀察(cha)到(dao)貼壁細(xi)胞(bao)形態為長(chang)梭(suo)狀，邊緣明亮(liang)。在(zai)傳代中(zhong)，P1 代細胞形態正常，密度(du)均勻(yun)。此後(hou)傳(chuan)代3次，無(wu)老(lao)化(hua)現(xian)象(xiang)。匯(hui)合度(du)較高(gao)時(shi)，細胞(bao)呈明顯漩渦(wo)狀(zhuang)極(ji)性。本產品(pin)可正常提取(qu)、培(pei)養 臍帶(dai)間(jian)質(zhi)幹細(xi)胞(bao) 。