NC膜(mo)與(yu)PVDF膜(mo)的(de)區別

膜(mo)的(de)選擇，印(yin)跡(ji)所(suo)使用的膜(mo)的(de)類型(xing)可(ke)能影響下列因素(su)：

NC膜(mo)和(he)PVDF膜(mo)是(shi)Western blotting中(zhong)常用(yong)的(de)兩(liang)種(zhong)膜(mo)。NC膜(mo)是(shi)世界(jie)上(shang)使(shi)用最為(wei)廣泛(fan)的(de)特(te)異性轉(zhuan)移介(jie)質之壹，也(ye)是最(zui)早(zao)用於Western blotting的膜(mo)。PVDF膜(mo)在(zai)1985年被(bei)開(kai)發(fa)出來(lai)，在(zai)嚴苛(ke)條(tiao)件(jian)下(xia)表現(xian)出更(geng)高(gao)的(de)蛋白(bai)保留(liu)，比(bi)如(ru)有機(ji)溶劑(ji)存在時，或(huo)者(zhe)在酸性或(huo)堿性條(tiao)件(jian)下(xia)。

NC膜(mo)與(yu)蛋白(bai)質(zhi)之間靠靜(jing)電和(he)疏水(shui)作用結合，NC膜(mo)是(shi)親水(shui)膜(mo)，無(wu)需預(yu)先活(huo)化(hua)，對(dui)蛋(dan)白(bai)質(zhi)的活性影響小；背景(jing)低(di)；價(jia)格低(di)廉，使用方便(bian)。缺點是(shi)韌性較(jiao)差(cha)，易損(sun)壞(huai)，不(bu)能反復使(shi)用(yong)。在非離子型(xing)去(qu)汙劑(ji)作用下，結合的(de)蛋(dan)白(bai)容(rong)易被(bei)洗(xi)脫(tuo)下(xia)來(lai)。

PVDF膜(mo)與(yu)蛋白(bai)質(zhi)之間靠疏水(shui)作用結合，與(yu)NC膜(mo)相(xiang)比(bi)，PVDF膜(mo)有著(zhe)更(geng)高(gao)的(de)機械強度(du)和(he)出色(se)的化(hua)學(xue)穩(wen)定性，適合多(duo)次(ci)剝(bo)離（stripping）和(he)反復檢(jian)測(ce)（reprobing）。同時，PVDF膜(mo)有著(zhe)更(geng)高(gao)的(de)結合能(neng)力(li)，NC膜(mo)的(de)典型(xing)結(jie)合能(neng)力(li)是80 -100 μg/cm2，而(er)PVDF膜(mo)達(da)到(dao)150-160 μg/cm2 （結(jie)合強(qiang)度(du) PVDF膜(mo)比(bi)NC膜(mo)強(qiang) 6 倍），這(zhe)意(yi)味著(zhe)靈敏(min)度(du)更(geng)高(gao)。由(you)於PVDF膜(mo)的(de)疏水(shui)性，成(cheng)為(wei)疏水(shui)蛋白(bai)質(zhi)（如(ru)膜(mo)蛋(dan)白(bai)）的(de)機構疏松(song)。也正(zheng)因為(wei)如(ru)此(ci)，PVDF膜(mo)需要(yao)甲(jia)醇潤濕(shi)才(cai)能(neng)被(bei)常規(gui)的(de)轉(zhuan)膜(mo)液所浸(jin)潤，繼(ji)而進(jin)行(xing)轉(zhuan)膜(mo)與(yu)蛋白(bai)結(jie)合。

綜(zong)上(shang)，現階(jie)段(duan)實(shi)驗室印(yin)跡(ji)轉(zhuan)印(yin)膜(mo)常用(yong)PVDF膜(mo)而(er)非NC膜(mo)。

在分(fen)子水(shui)平(ping)，蛋(dan)白(bai)質(zhi)吸附至(zhi)少(shao)部(bu)分(fen)源於疏水(shui)氨(an)基(ji)酸側(ce)鏈(lian)與(yu)聚(ju)合物(wu)表面疏水(shui)區的(de)相(xiang)互作用。Matsudaira（1987）觀察到(dao)，在(zai)疏水(shui)殘(can)基(ji)被(bei)切割之後，小肽的測(ce)序效(xiao)率(lv)下(xia)降80%，這(zhe)可(ke)能是(shi)由於殘(can)余肽段被(bei)洗(xi)脫(tuo)。同時，在(zai)肽段消(xiao)化(hua)降(jiang)解時，也(ye)觀(guan)察到(dao)疏水(shui)肽段往(wang)往不(bu)能像(xiang)親水(shui)肽段那(na)樣高(gao)效洗(xi)脫(tuo)（Iwamatsu，1991；Fernandez等，1992）。McKeon和(he)Lyman（1991）發(fa)現，轉(zhuan)印(yin)緩(huan)沖液中(zhong)添(tian)加的Ca2+離子可(ke)增(zeng)強(qiang)鈣調(tiao)蛋(dan)白(bai)與(yu)Immobilon®-P轉(zhuan)印(yin)膜(mo)的(de)結合。鈣的結合導(dao)致(zhi)蛋白(bai)質(zhi)分(fen)子結(jie)構中(zhong)形成壹個(ge)疏水(shui)袋，從(cong)而(er)增(zeng)加蛋白(bai)與(yu)膜(mo)的(de)結合。

綜(zong)上(shang)，PVDF膜(mo)結(jie)合蛋(dan)白(bai)的(de)機理(li)：PVDF膜(mo)的(de)表面具有疏水(shui)性，而(er)許(xu)多(duo)蛋(dan)白(bai)質(zhi)也具有疏水(shui)性區(qu)域，PVDF膜(mo)表面和(he)蛋白(bai)質(zhi)疏水(shui)區域之間發(fa)生疏水(shui)作用導(dao)致(zhi)其相(xiang)互結(jie)合。

PVDF膜(mo)為(wei)什麽(me)需預(yu)先活(huo)化(hua)：

PVDF膜(mo)本(ben)質是(shi)壹(yi)種(zhong)疏水(shui)性的(de)聚(ju)合物(wu)，具有疏水(shui)性且(qie)不(bu)帶電荷，不(bu)能被(bei)轉(zhuan)膜(mo)液所浸(jin)潤，為(wei)了在水(shui)性緩(huan)沖液中(zhong)使用(yong)，需要(yao)在使(shi)用前進(jin)行(xing)預(yu)處理(li)以浸(jin)潤和(he)活化(hua)膜(mo)。最(zui)常見的(de)方法是使用(yong)50%（v/v）或(huo)更(geng)高(gao)濃(nong)度的(de)醇（甲(jia)醇、乙(yi)醇和(he)異丙醇）溶(rong)液浸(jin)潤和(he)活化(hua)，使(shi)PVDF膜(mo)中(zhong)微孔(kong)內的(de)空(kong)氣(qi)被(bei)低(di)表面張力(li)的甲(jia)醇所(suo)替(ti)代(dai)，從而易於後續(xu)水(shui)或者(zhe)緩(huan)沖液進入(ru)PVDF膜(mo)中(zhong)的微孔(kong)內，使(shi)PVDF膜(mo)從(cong)疏水(shui)性變(bian)成親(qin)水(shui)性，隨(sui)著(zhe)膜(mo)的(de)外觀從不(bu)透(tou)明變(bian)為(wei)半透(tou)明，表明(ming)PVDF膜(mo)已(yi)經浸(jin)濕(shi)。之後用(yong)水(shui)反復沖洗(xi)以(yi)去(qu)除(chu)醇類(lei)，再(zai)將(jiang)膜(mo)直(zhi)接放入轉(zhuan)印(yin)緩(huan)沖液中(zhong)平(ping)衡(heng)。壹(yi)旦(dan)膜(mo)被(bei)浸(jin)濕(shi)，通(tong)過電轉(zhuan)移，蛋(dan)白(bai)質(zhi)與膜(mo)接觸(chu)產(chan)生(sheng)疏水(shui)作用而被(bei)吸(xi)附(fu)在PVDF膜(mo)上(shang)。

在電轉(zhuan)移過(guo)程中(zhong)，蛋白(bai)與(yu)膜(mo)的(de)結合貫(guan)穿(chuan)整(zheng)個(ge)膜(mo)的(de)厚(hou)度(深(shen)度(du))，結合能(neng)力(li)是由(you)孔(kong)的內(nei)部(bu)表面積(ji)來(lai)決(jue)定的（Mansfield，1994）。隨著(zhe)膜(mo)孔(kong)徑的(de)不(bu)斷(duan)減(jian)小，膜(mo)對(dui)低(di)分(fen)子量(liang)的(de)蛋(dan)白(bai)結(jie)合就(jiu)越(yue)牢(lao)固(gu)，但是膜(mo)孔(kong)徑如(ru)果小於0.1 μm，蛋白(bai)的(de)轉(zhuan)移就(jiu)很(hen)難(nan)進(jin)行(xing)了，原因是蛋(dan)白(bai)質(zhi)分(fen)子的(de)直(zhi)徑大約(yue)在1-100納(na)米(mi)之間。

PVDF膜(mo)孔(kong)徑越(yue)小對低(di)分(fen)子蛋(dan)白(bai)吸(xi)附越牢(lao)固(gu)的(de)機(ji)理(li)：較小的孔(kong)徑會(hui)限制蛋白(bai)分(fen)子的(de)運(yun)動(dong)，使(shi)其轉(zhuan)移速(su)度變(bian)慢，蛋(dan)白(bai)與(yu)膜(mo)的(de)結合更(geng)充分(fen)，更(geng)容(rong)易(yi)被(bei)攔截在(zai)孔(kong)道(dao)內。此(ci)外(wai)，較(jiao)小的孔(kong)徑也(ye)可(ke)以提(ti)供(gong)更(geng)高(gao)的(de)膜(mo)表面積(ji)，從(cong)而提(ti)高了蛋白(bai)與(yu)膜(mo)接觸(chu)的機(ji)會(hui)。同時，較(jiao)小的孔(kong)徑也(ye)可(ke)以提(ti)供(gong)更(geng)高(gao)的(de)表面密(mi)度(du)，從而(er)增(zeng)加了孔(kong)道(dao)與溶(rong)液之間的(de)分(fen)子間吸(xi)引力(li)，這(zhe)種(zhong)吸(xi)附(fu)方式稱為(wei)“毛細(xi)作用"。Schweitzer和(he)Kriz在壹項(xiang)研究中(zhong)發(fa)現，較(jiao)小的孔(kong)徑可(ke)以提(ti)供(gong)更(geng)高(gao)的(de)蛋白(bai)密(mi)度並(bing)增(zeng)強(qiang)其吸附能(neng)力(li)。另壹(yi)方面，蛋(dan)白(bai)分(fen)子量(liang)越(yue)低(di)，蛋(dan)白(bai)的(de)比(bi)表面積(ji)越(yue)大，與(yu)膜(mo)接觸(chu)面越(yue)大越(yue)充分(fen)，結合更(geng)緊密(mi)。

通(tong)常情(qing)況下(xia)，大於20 kD的蛋(dan)白(bai)選(xuan)擇0.45 μm的(de)膜(mo)，小於20 kD的蛋(dan)白(bai)選(xuan)擇0.2 μm的(de)膜(mo)。0.2 μm PVDF膜(mo)內(nei)部(bu)表面積(ji)大約(yue)是0.45 μm PVDF 膜(mo)的(de)三倍，使其(qi)吸(xi)附(fu)能力(li)更(geng)高(gao)。總之，選擇PVDF膜(mo)的(de)孔(kong)徑大小需要(yao)根據樣品蛋(dan)白(bai)的(de)大小和(he)特(te)性來(lai)確(que)定，以獲(huo)得較(jiao)好的結合效(xiao)果。