流(liu)式細胞(bao)儀(yi)熒光結(jie)果(guo)分(fen)析中的常見問(wen)題及(ji)解(jie)決(jue)方(fang)法

   流(liu)式細胞(bao)儀(yi)是壹(yi)種用於(yu)細(xi)胞(bao)分(fen)析的實驗(yan)室(shi)儀(yi)器，它能夠對單(dan)個細胞(bao)進(jin)行快速(su)而(er)精(jing)確(que)的定量和質量分(fen)析。它主(zhu)要(yao)通(tong)過將細(xi)胞(bao)懸浮液註(zhu)入(ru)到(dao)儀(yi)器中，利用激(ji)光(guang)器照(zhao)射細胞(bao)並檢測(ce)經(jing)過細(xi)胞(bao)的光線(xian)散(san)射和熒光(guang)信(xin)號，從而獲取大量有(you)關(guan)細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai)、大小、復雜度(du)、表面標(biao)記以及(ji)內部分(fen)子(zi)的信(xin)息(xi)。它(ta)可同(tong)時(shi)測量多(duo)個參數(shu)，並具(ju)備(bei)高(gao)通(tong)量性(xing)能(neng)，能(neng)夠快速分析數以萬計(ji)的細胞(bao)，並提(ti)供(gong)詳(xiang)細的統計(ji)學(xue)數(shu)據(ju)。它廣(guang)泛應用於(yu)免(mian)疫學(xue)、細胞(bao)生(sheng)物(wu)學、藥理(li)學(xue)、腫瘤(liu)學(xue)等(deng)領域的研究(jiu)和實驗(yan)中。

    然(ran)而(er)，在(zai)分析流(liu)式細胞(bao)儀(yi)得到(dao)的熒光(guang)結(jie)果(guo)時(shi)，常常會遇(yu)到(dao)壹(yi)些(xie)問(wen)題，如(ru)信(xin)號強度弱、背景(jing)高(gao)、細胞(bao)群(qun)分(fen)布(bu)異(yi)常等(deng)。本文將介(jie)紹常見問(wen)題，並提(ti)供(gong)相(xiang)應的解(jie)決(jue)方(fang)法。

壹(yi)、信(xin)號強度弱

1. 信(xin)號補(bu)償(chang)不正(zheng)確(que)：檢查(zha)流(liu)式細胞(bao)儀(yi)上的單(dan)色(se)陽性(xing)對照(zhao)是(shi)否(fou)設置正確(que)，並確(que)保(bao)門(men)控和補償(chang)設置正確(que)。

2. 用於(yu)檢測(ce)的抗體不足(zu)：增加抗體的量或濃度(du)。

二(er)、熒(ying)光(guang)強度高(gao)

1. 抗體濃(nong)度過高(gao)：減少(shao)每(mei)個樣(yang)本中添(tian)加的抗體量。

2. 過(guo)量抗體被(bei)捕獲：洗滌(di)步(bu)驟要充(chong)分，並在(zai)洗滌緩(huan)沖(chong)液中加入(ru)吐溫或Triton，以保(bao)持(chi)細胞(bao)的透化作(zuo)用。

3. 封閉不足(zu)：在抗體混(hun)合液(ye)中(zhong)加入(ru)1%-3%的封閉劑，並增(zeng)加封閉步驟。

三(san)、背景(jing)高(gao)/陽性(xing)細胞(bao)百(bai)分(fen)比高(gao)

1. 增益(yi)設置過高(gao)/補償(chang)過低(di)：使(shi)用陽(yang)性(xing)對照(zhao)正(zheng)確(que)設(she)置流(liu)式細胞(bao)儀(yi)，並使(shi)用補(bu)償(chang)減少(shao)小(xiao)顆(ke)粒(li)背景(jing)信(xin)號和降低增(zeng)益(yi)。

2. 抗體過(guo)量：降低抗體的濃度(du)，並在(zai)洗滌緩(huan)沖(chong)液中加入(ru)去汙(wu)劑(ji)，確(que)保(bao)洗(xi)去過量的抗體。

四(si)、在應該(gai)只(zhi)有(you)壹(yi)個細胞(bao)群(qun)的情況下(xia)觀(guan)察到(dao)兩(liang)個或多(duo)個細胞(bao)群(qun)

1. 表達(da)靶蛋白(bai)的細胞(bao)群(qun)不止(zhi)壹(yi)個：檢查(zha)樣(yang)本中包含的細胞(bao)類(lei)型(xing)預期的蛋白(bai)表達(da)水(shui)平，並確(que)保(bao)細(xi)胞(bao)充(chong)分(fen)分(fen)離(li)。

2. 出(chu)現細(xi)胞(bao)雙(shuang)峰(feng)：細(xi)胞(bao)雙(shuang)峰(feng)顯示為(wei)第二(er)大細胞(bao)群(qun)，其熒光(guang)強度大約是(shi)單(dan)細(xi)胞(bao)熒(ying)光(guang)強度的兩(liang)倍(bei)。在(zai)染(ran)色(se)前用移液(ye)槍(qiang)將細(xi)胞(bao)輕(qing)柔混(hun)勻，並在(zai)細胞(bao)儀(yi)中運行之前(qian)再次(ci)混(hun)勻。

五(wu)、側(ce)向(xiang)散射背景(jing)偏(pian)高(gao)（來(lai)自(zi)小顆(ke)粒(li)）

1. 細胞(bao)裂(lie)解(jie)：確(que)保(bao)樣(yang)本中的細胞(bao)沒(mei)有(you)裂(lie)解(jie)和破(po)碎，樣(yang)本應新(xin)鮮(xian)並正(zheng)確(que)制(zhi)備(bei)，避免(mian)高(gao)速離(li)心或激烈(lie)渦旋(xuan)的操作(zuo)。

2. 細(xi)菌汙(wu)染(ran)：確(que)保(bao)樣(yang)本不受細(xi)菌(jun)汙(wu)染(ran)，細菌會自(zi)動發出(chu)較弱(ruo)的熒光(guang)，導(dao)致高(gao)事(shi)件率。

六(liu)、低(di)事(shi)件率

1. 每(mei)毫(hao)升的細胞(bao)數(shu)過(guo)少(shao)：將細(xi)胞(bao)稀釋(shi)至1×105至1×106個細胞(bao)/mL，確(que)保(bao)細(xi)胞(bao)均勻(yun)混(hun)合。

2. 細(xi)胞(bao)聚(ju)集(ji)阻(zu)塞管(guan)道(dao)：在染(ran)色(se)前輕(qing)柔吹打幾(ji)次(ci)，確(que)保(bao)得到(dao)同(tong)源單(dan)細(xi)胞(bao)懸液，也(ye)可以篩(shai)選或過濾細胞(bao)，去除團(tuan)塊。

七(qi)、高(gao)事(shi)件率

1. 細(xi)胞(bao)數(shu)量過(guo)多(duo)：稀釋(shi)樣(yang)本至1×105至1×106個細胞(bao)/mL。

   通(tong)過以上(shang)問(wen)題及(ji)解(jie)決(jue)方(fang)法，我(wo)們(men)可以更(geng)好(hao)地(di)分析流(liu)式細胞(bao)儀(yi)得到(dao)的熒光(guang)結(jie)果(guo)。然(ran)而(er)，需(xu)要(yao)註意的是，不同(tong)實驗(yan)條件可能會導(dao)致不同(tong)的問(wen)題和解(jie)決(jue)方(fang)法。因此(ci)，根(gen)據(ju)實際(ji)情況，選擇合適的解(jie)決(jue)方(fang)案(an)是很(hen)重(zhong)要的。同(tong)時(shi)，定期檢查(zha)和維(wei)護流(liu)式細胞(bao)儀(yi)，以確(que)保(bao)其正常運行，也(ye)是(shi)避免(mian)問(wen)題發(fa)生(sheng)的重(zhong)要措(cuo)施(shi)。     

    蘇州(zhou)阿(e)爾法生(sheng)物(wu)提(ti)供(gong)的進口(kou) GuavaregMuereg細(xi)胞(bao)分(fen)析儀(yi)， ImageStream®X MkII成(cheng)像 流(liu)式細胞(bao)分(fen)析儀(yi)是將流(liu)式 細胞(bao)儀(yi)的高(gao)檢測(ce)速(su)度、高(gao)靈敏(min)度以及(ji)表型(xing)分(fen)析能力與顯微鏡的高(gao)分辨圖像(xiang)及(ji)功能(neng)性研究(jiu)結(jie)合。ImageStreamX MkII系統屬(shu)於臺(tai)式多(duo)色(se)成(cheng)像 流(liu)式 細胞(bao)儀(yi)，可采集(ji)多(duo)達12個通(tong)道(dao)的細胞(bao)圖像(xiang)。