cDNA基(ji)因(yin)克(ke)隆(long)的原(yuan)理和步驟

基(ji)因克(ke)隆(long)是(shi)分子生(sheng)物(wu)學中壹項重要的(de)技術(shu)，它使(shi)得科研(yan)人(ren)員(yuan)能(neng)夠克(ke)隆(long)、擴增(zeng)和研(yan)究特定(ding)基因(yin)序(xu)列，為基因功能(neng)和調控(kong)機制(zhi)的研(yan)究提(ti)供(gong)了(le)強(qiang)有(you)力(li)的工具。cDNA克(ke)隆(long)則是(shi)基(ji)因克(ke)隆(long)的壹(yi)種常見(jian)形(xing)式，它通(tong)過(guo)將(jiang)mRNA 轉錄(lu)為DNA並(bing)將(jiang)其插入(ru)細(xi)菌(jun)質粒中(zhong)，用於研(yan)究基因(yin)的表達(da)和功能(neng)。本文(wen)將(jiang)詳細(xi)介(jie)紹基因(yin)克(ke)隆(long)和 cDNA克(ke)隆(long)的原(yuan)理和步驟。

壹(yi)、基(ji)因克(ke)隆(long)的原(yuan)理和步驟

基(ji)因(yin)克(ke)隆(long)是(shi)將(jiang)目標基(ji)因(yin)從宿主(zhu)生物(wu)體(ti)中(zhong)剪(jian)切出(chu)來，並(bing)將(jiang)其克(ke)隆(long)到載(zai)體分子中(zhong)的(de)過(guo)程(cheng)。基(ji)因(yin)克(ke)隆(long)的原(yuan)理和步驟如(ru)下：

1. 分離(li)目(mu)標(biao)基(ji)因：從生(sheng)物(wu)體(ti)中(zhong)提(ti)取DNA，並(bing)使(shi)用(yong)限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)切割(ge)目標(biao)基(ji)因(yin)的DNA序(xu)列。限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)是(shi)壹(yi)類(lei)能(neng)夠在特(te)定(ding)的(de)核(he)酸(suan)序(xu)列上(shang)切割(ge)DNA的酶(mei)。通(tong)過(guo)選(xuan)擇(ze)適當(dang)的限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)，可(ke)以(yi)剪切出(chu)目(mu)標(biao)基(ji)因的特定DNA片(pian)段。

2. 構建(jian)載(zai)體分子：選(xuan)擇(ze)壹個(ge)適當(dang)的載(zai)體分子，如(ru)質粒，將(jiang)其進(jin)行限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)切割(ge)。切割(ge)後的(de)載(zai)體分子將(jiang)產生兩(liang)個(ge)或(huo)多(duo)個(ge)裂(lie)開的末端(duan)。

3. 連接目(mu)標(biao)基因和載(zai)體：將(jiang)目標基(ji)因(yin)的DNA片(pian)段與(yu)裂開的載(zai)體分子末端(duan)進(jin)行連接。這(zhe)個(ge)過(guo)程(cheng)需(xu)要使(shi)用(yong)DNA連接酶(mei)，如(ru)T4 DNA連(lian)接酶(mei)。DNA連(lian)接酶(mei)能(neng)夠將(jiang)兩個(ge)DNA片(pian)段連(lian)接在壹(yi)起(qi)，形(xing)成(cheng)壹(yi)個(ge)完(wan)整(zheng)的(de)DNA分子。

4. 轉(zhuan)化(hua)宿主(zhu)細(xi)胞(bao)：將(jiang)連接好(hao)的目(mu)標基(ji)因(yin)和載(zai)體分子轉(zhuan)化(hua)到宿主(zhu)細(xi)胞(bao)中(zhong)。通(tong)常(chang)使用大腸(chang)桿(gan)菌(jun)作(zuo)為宿主(zhu)細(xi)胞(bao)，轉(zhuan)化過(guo)程(cheng)中(zhong)使(shi)用適當(dang)的選(xuan)擇性(xing)培(pei)養基(ji)，如含有抗(kang)生素的培(pei)養基(ji)。只有帶有目(mu)標(biao)基(ji)因和載(zai)體的(de)細(xi)胞(bao)才能(neng)在選(xuan)擇(ze)性(xing)培(pei)養基(ji)上(shang)生長(chang)。

5. 篩選(xuan)和鑒定(ding)：經(jing)過(guo)轉(zhuan)化(hua)和培(pei)養後(hou)，篩選出(chu)含(han)有(you)目(mu)標基因的克(ke)隆(long)細(xi)胞(bao)。常(chang)用的(de)鑒(jian)定方(fang)法(fa)包(bao)括(kuo)PCR分析(xi)，限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)切割(ge)和DNA測(ce)序(xu)等。這些方(fang)法(fa)可(ke)以(yi)驗證(zheng)克(ke)隆(long)細(xi)胞(bao)是(shi)否(fou)含有(you)目(mu)標(biao)基因(yin)，並(bing)確(que)認(ren)其(qi)序(xu)列是(shi)否(fou)正(zheng)確(que)。

二、cDNA克(ke)隆(long)的原(yuan)理和步驟

cDNA克(ke)隆(long)是(shi)將(jiang)mRNA轉錄(lu)為DNA並(bing)將(jiang)其插入(ru)細(xi)菌(jun)質粒中(zhong)的過(guo)程(cheng)，用(yong)於(yu)研(yan)究基因(yin)的表達(da)和功能(neng)。cDNA克(ke)隆(long)的原(yuan)理和步驟如(ru)下：

1. 分離(li)mRNA：從細(xi)胞(bao)中(zhong)分離(li)出(chu)總(zong)RNA，然(ran)後(hou)使(shi)用反轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)將(jiang)mRNA轉錄(lu)為cDNA。反轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)是(shi)壹(yi)種與RNA相(xiang)關的DNA聚(ju)合酶(mei)，它能(neng)夠使用RNA作(zuo)為模板合成(cheng)cDNA的(de)第(di)壹鏈。這樣(yang)就(jiu)得到了(le)含(han)有目(mu)標基因信息(xi)的cDNA。

2. cDNA第(di)壹鏈合成(cheng)：利(li)用(yong)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)和引物(wu)，在cDNA模(mo)板上(shang)合成(cheng)第(di)壹鏈。引物(wu)通(tong)常(chang)是(shi)寡(gua)聚(ju)dT引物(wu)，能(neng)夠與mRNA的聚(ju)腺(xian)苷(gan)尾(wei)端(duan)結(jie)合。逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)將(jiang)在引(yin)物(wu)的(de)引(yin)導(dao)下，在cDNA模(mo)板上(shang)進(jin)行DNA合成(cheng)。這(zhe)樣(yang)就(jiu)得到了(le)cDNA的(de)第(di)壹鏈。

3. cDNA第(di)二鏈合成(cheng)：合(he)成(cheng)cDNA第(di)二鏈的方(fang)法(fa)有(you)自(zi)主(zhu)啟動(dong)和替(ti)代合成(cheng)兩(liang)種。自(zi)主(zhu)啟動(dong)是(shi)通(tong)過(guo)DNA聚(ju)合酶(mei)復(fu)制(zhi)在第(di)壹鏈上(shang)進(jin)行合成(cheng)，而(er)替(ti)代合成(cheng)則利用(yong)RNA引物(wu)在cDNA模(mo)板上(shang)進(jin)行第(di)二鏈的合(he)成(cheng)。

4. 克(ke)隆(long)cDNA：將(jiang)合成(cheng)好(hao)的cDNA插入(ru)細(xi)菌(jun)質粒中(zhong)，構建(jian)成(cheng)重(zhong)組(zu)質粒。質粒通(tong)常(chang)具有抗(kang)生素耐(nai)藥性，以便(bian)篩選(xuan)含有(you)cDNA的克(ke)隆(long)細(xi)胞(bao)。轉(zhuan)化後(hou)，通(tong)過(guo)選(xuan)擇(ze)性(xing)培(pei)養基(ji)，篩選出(chu)帶(dai)有(you)目(mu)標cDNA的克(ke)隆(long)細(xi)胞(bao)。

5. 宿主(zhu)細(xi)胞(bao)導(dao)入：選(xuan)用(yong)適當(dang)的細(xi)菌(jun)作(zuo)為宿主(zhu)細(xi)胞(bao)，如(ru)大腸(chang)桿(gan)菌(jun)，將(jiang)重組質粒導(dao)入到宿主(zhu)細(xi)胞(bao)中(zhong)。常用(yong)的(de)方(fang)法(fa)是(shi)通(tong)過(guo)熱(re)激(ji)轉(zhuan)化(hua)或(huo)電(dian)轉(zhuan)化將(jiang)重組質粒轉(zhuan)化到細(xi)菌(jun)中(zhong)。

6. 克(ke)隆(long)選擇(ze)：通(tong)過(guo)篩(shai)選(xuan)和鑒定(ding)來確(que)定(ding)含(han)有(you)目(mu)標(biao)cDNA的克(ke)隆(long)細(xi)胞(bao)。常(chang)用的(de)篩(shai)選方(fang)法(fa)包(bao)括(kuo)抗(kang)生素耐(nai)藥性選擇和蛋白質檢測(ce)。通(tong)過(guo)將(jiang)克(ke)隆(long)細(xi)胞(bao)培(pei)養在含(han)有(you)特(te)定抗(kang)生素的培(pei)養基(ji)上(shang)，只有帶有重(zhong)組(zu)質粒的(de)細(xi)胞(bao)才能(neng)生長(chang)。另外，也(ye)可以通(tong)過(guo)檢測(ce)目(mu)標(biao)蛋白質的(de)存在來鑒(jian)定帶(dai)有(you)目(mu)標cDNA的克(ke)隆(long)細(xi)胞(bao)。

基(ji)因克(ke)隆(long)和cDNA克(ke)隆(long)是(shi)研(yan)究基因(yin)功能(neng)和調控(kong)機制(zhi)的重(zhong)要工(gong)具(ju)。基因(yin)克(ke)隆(long)通(tong)過(guo)將(jiang)目標基(ji)因(yin)剪切並(bing)克(ke)隆(long)到載(zai)體分子中(zhong)，實(shi)現了(le)目標基因的(de)擴增(zeng)和研(yan)究。cDNA克(ke)隆(long)則通(tong)過(guo)將(jiang)mRNA轉錄(lu)為cDNA並(bing)插入(ru)到細(xi)菌(jun)質粒中(zhong)，用於研(yan)究基因(yin)的表達(da)和功能(neng)。這些基因克(ke)隆(long)和 cDNA克(ke)隆(long)的原(yuan)理和步驟 為分子生(sheng)物(wu)學研(yan)究提(ti)供(gong)了(le)有力(li)的手段，並(bing)在基(ji)因(yin)組(zu)學和生物(wu)醫(yi)學研(yan)究中扮(ban)演著(zhe)重(zhong)要角(jiao)色(se)。

 蘇州(zhou)阿爾(er)法生(sheng)物(wu)十(shi)四(si)年(nian)致力(li)於生物(wu)實(shi)驗(yan)室(shi)儀器(qi)設(she)備(bei)、實(shi)驗試(shi)劑、實(shi)驗(yan)耗(hao)材(cai)供(gong)應(ying),所提(ti)供(gong)的(de)分子生(sheng)物(wu)學設(she)備(bei)包(bao)括(kuo)：PCR儀、熒光定(ding)量(liang)PCR、核(he)酸(suan)提(ti)取儀(yi)、凝膠電(dian)泳儀(yi)、電(dian)泳槽、移液(ye)槍、高速(su)冷(leng)凍離(li)心(xin)機、超低(di)溫冰箱(xiang)、超速(su)離(li)心(xin)機、分光光度計、冷(leng)凍離(li)心(xin)機等 實驗(yan)室(shi)儀器(qi)，分子生(sheng)物(wu)學試劑耗材包(bao)括(kuo)PCR管(guan)、8排管(guan)、離(li)心(xin)管(guan)、PCR擴(kuo)增(zeng)試劑(ji)盒、DNA酶(mei)切酶(mei)、RNA提(ti)取試(shi)劑盒、質粒提(ti)取試(shi)劑盒、熒光染料(liao)、PCR引物(wu)等。更多(duo)基(ji)因克(ke)隆(long)和   cDNA克(ke)隆(long)的原(yuan)理和步驟 基(ji)因(yin)克(ke)隆(long)儀器(qi)、生(sheng)物(wu)試(shi)劑(ji)、耗(hao)材(cai)