細胞(bao)傳(chuan)代(dai)方法(fa)

壹、細胞(bao)解(jie)凍(dong)方法(fa)：

準(zhun)備壹個(ge)培養(yang)培養(yang)瓶，使(shi)其包(bao)含產(chan)品(pin)說明(ming)書中(zhong)列(lie)出(chu)的推薦體積的適(shi)當培養(yang)基，並(bing)針對(dui)溫度和 pH (CO 2 )進行(xing)平衡(heng)。

在 37°C 或(huo)該(gai)細胞(bao)系(xi)的正常生(sheng)長(chang)溫度下，在水浴中(zhong)輕輕攪拌解(jie)凍(dong)小瓶。解(jie)凍(dong)應該(gai)很(hen)快，大(da)約(yue) 2 分鐘(zhong)或(huo)直到冰(bing)晶(jing)融(rong)化。

從(cong)水(shui)浴中(zhong)取(qu)出(chu)小瓶，並(bing)通過浸(jin)入或(huo)噴灑 70% 乙(yi)醇來(lai)凈化。在層(ceng)流組(zu)織(zhi)培(pei)養(yang)罩中(zhong)遵(zun)循(xun)嚴(yan)格(ge)的無菌(jun)條件(jian)進(jin)行(xing)所(suo)有(you)進(jin)壹(yi)步操(cao)作。

擰(ning)下(xia)小瓶的頂(ding)部並將(jiang)內容(rong)物(wu)轉移(yi)到含有(you) 9 mL 推薦培(pei)養(yang)基的無菌(jun)離(li)心管中(zhong)。通過溫和離(li)心（125 × g 10 分鐘(zhong)）去(qu)除冷(leng)凍(dong)保(bao)護劑(ji) (DMSO)。丟(diu)棄上(shang)清(qing)液(ye)，將(jiang)細胞(bao)重(zhong)懸(xuan)於 1 或(huo) 2 mL 培養(yang)基中(zhong)。將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)浮液(ye)轉移(yi)到含有(you)生長(chang)培(pei)養(yang)基的培養(yang)培養(yang)瓶中(zhong)，並通過輕輕搖(yao)動混(hun)合。

24 小時(shi)後檢查(zha)細胞(bao)培(pei)養(yang)物(wu)，並(bing)根據(ju)需(xu)要(yao)進(jin)行(xing)繼(ji)代(dai)培(pei)養(yang)。

這裏(li)需(xu)要(yao)註意的是：壹些細胞(bao)系(xi)可(ke)能需(xu)要(yao)幾(ji)天時(shi)間(jian)才(cai)能從冷(leng)凍(dong)保(bao)存中(zhong)恢(hui)復。比如(ru)：壹(yi)些雜瘤細胞(bao)在培養(yang)的第壹天活力(li)很(hen)差，會(hui)產生細胞(bao)碎(sui)片。解(jie)凍(dong)後(hou)，細胞(bao)將(jiang)開(kai)始(shi)恢(hui)復並進(jin)入指(zhi)數(shu)增(zeng)長(chang)。

二、解(jie)凍(dong)後(hou)的細胞(bao)處理：

壹(yi)些細胞(bao)供貨(huo)商為保(bao)證成(cheng)活率(lv)，會(hui)解(jie)凍(dong)後(hou)進(jin)行(xing)發(fa)貨(huo)運(yun)輸(shu)。這(zhe)些培養(yang)瓶用(yong)細胞(bao)接(jie)種，孵(fu)育(yu)以(yi)確(que)保(bao)細胞(bao)生(sheng)長(chang)，然(ran)後填充(chong)培(pei)養(yang)基以(yi)進(jin)行(xing)運(yun)輸(shu)。

收到細胞(bao)培(pei)養(yang)物(wu)後(hou)，需(xu)要(yao)目(mu)視檢查培養(yang)基是(shi)否(fou)存(cun)在微生(sheng)物(wu)汙染(ran)的宏觀證據(ju)。這(zhe)包(bao)括(kuo)異常的 pH 值變化（酚(fen)紅的黃色或(huo)紫色）、渾濁或(huo)顆粒。使(shi)用(yong)低倍率(lv) (100×) 的倒置(zhi)顯(xian)微(wei)鏡檢查培養(yang)基是(shi)否(fou)存(cun)在微生(sheng)物(wu)汙染(ran)的證據(ju)以(yi)及細胞(bao)的形態。

如(ru)果(guo)細胞(bao)貼(tie)壁(bi)並以(yi)單(dan)層(ceng)生長(chang)：

• 如(ru)果(guo)細胞(bao)已(yi)經貼(tie)附並形成單層(ceng)，可(ke)能需(xu)要(yao)維(wei)持(chi)細胞(bao)的生長(chang)狀(zhuang)態(tai)和健康狀(zhuang)態(tai)，以(yi)便繼(ji)續(xu)進(jin)行(xing)下(xia)壹(yi)步(bu)實(shi)驗(yan)或(huo)分析。以(yi)下(xia)是壹(yi)些(xie)建(jian)議來(lai)維(wei)護(hu)單(dan)層(ceng)細胞(bao)的生長(chang)和健康狀(zhuang)態(tai)：

• 保(bao)持培(pei)養(yang)基的新(xin)鮮和適(shi)當的營養(yang)：必須經常更換液(ye)體培(pei)養(yang)基，以(yi)保(bao)持適(shi)當的pH，滲透壓和營養(yang)素(su)含量。常用(yong)的方式(shi)是定(ding)期(qi)檢查培(pei)養(yang)基的酸(suan)堿度(du)和滴定(ding)度(du)，做(zuo)好消(xiao)毒和表面清潔，防止細菌(jun)、真(zhen)菌(jun)、病(bing)毒的交(jiao)叉(cha)感(gan)染(ran)。

• 檢(jian)查和調整(zheng)環(huan)境參(can)數(shu)：為了(le)維(wei)護(hu)細胞(bao)的生長(chang)狀(zhuang)況(kuang)，必須保(bao)證細胞(bao)在適(shi)當的環境因(yin)素(su)下(xia)培(pei)養(yang)。推薦(jian)將(jiang)細胞(bao)培(pei)養(yang)於CO2孵(fu)化(hua)器中(zhong)，溫度保(bao)持在37攝(she)氏(shi)度(du)下。定(ding)期(qi)檢查溫度、濕度(du)和氣(qi)體(ti)氧氣(qi)濃(nong)度，以(yi)便使(shi)它們(men)符合細胞(bao)類(lei)型的要求(qiu)。

• 定(ding)期(qi)更換培(pei)養(yang)基：細胞(bao)每(mei)壹(yi)到兩(liang)天將(jiang)需(xu)要(yao)更換培(pei)養(yang)基，以(yi)便消(xiao)除可(ke)能產生(sheng)的有害(hai)代(dai)謝產(chan)物(wu)、細胞(bao)分(fen)泌物(wu)和懸(xuan)浮物(wu)。這(zhe)還可(ke)以(yi)幫(bang)助(zhu)保(bao)持適(shi)當的pH和離(li)子(zi)濃度，並提供營養(yang)物(wu)質(zhi)來促(cu)進細胞(bao)增(zeng)殖和擴增(zeng)。

• 定(ding)期(qi)找出(chu)並(bing)處理細胞(bao)培(pei)養(yang)中的汙染(ran)：如(ru)果(guo)發(fa)現(xian)細胞(bao)培(pei)養(yang)中存(cun)在汙染(ran)的跡象，需(xu)要(yao)立即找出(chu)並(bing)處理。建(jian)議采(cai)取(qu)逆(ni)向(xiang)染(ran)色方法(fa)，比如(ru)酚(fen)紅染(ran)色，而不是道(dao)理西(xi)的吉姆薩(sa)染(ran)色，以(yi)避免(mian)影(ying)響細胞(bao)健康和形態。處理汙染(ran)將(jiang)需(xu)要(yao)使(shi)用(yong)抗生(sheng)素(su)、抗(kang)真(zhen)菌(jun)藥(yao)物(wu)等(deng)，但(dan)必須謹(jin)慎使(shi)用(yong)，以(yi)避免(mian)對(dui)細胞(bao)的毒性和不良影(ying)響。

• 監(jian)測(ce)細胞(bao)增(zeng)殖和活性(xing)：對(dui)於(yu)已(yi)經貼(tie)壁(bi)並形成單層(ceng)的細胞(bao)，可(ke)以(yi)使(shi)用(yong)視覺方式(shi)或(huo)其他(ta)方法(fa)監(jian)測(ce)細胞(bao)的增(zeng)殖和活性(xing)。例(li)如(ru)，可(ke)以(yi)檢(jian)測(ce)細胞(bao)形態、顏色和密度，以(yi)了(le)解(jie)細胞(bao)數(shu)量和健康狀(zhuang)態(tai)。建(jian)議采(cai)用(yong)背景熄(xi)滅的方法(fa)來觀(guan)察細胞(bao)的數(shu)量和活性(xing)，比(bi)如(ru)MTT、CCK-8等(deng)方法(fa)。

大多數(shu)細胞(bao)系(xi)開(kai)始(shi)於原代(dai)培(pei)養(yang)物(wu)，原(yuan)代(dai)培(pei)養(yang)物(wu)來(lai)源(yuan)於(yu)壹塊切碎(sui)的或(huo)酶(mei)分散的組(zu)織(zhi)。原(yuan)代(dai)培(pei)養(yang)物(wu)作(zuo)為幾種細胞(bao)類(lei)型的混合物(wu)，保(bao)留了(le)它們(men)來源(yuan)組(zu)織(zhi)的特征。

壹段時(shi)間(jian)後，原(yuan)代(dai)培(pei)養(yang)物(wu)將(jiang)達到匯(hui)合狀(zhuang)態(tai)，即(ji)由於(yu)細胞(bao)擴(kuo)張而覆蓋(gai)培(pei)養(yang)培養(yang)瓶所(suo)有(you)可(ke)用(yong)空間(jian)的狀(zhuang)態(tai)。此(ci)時(shi)，需(xu)要(yao)將(jiang)培養(yang)物(wu)分(fen)解(jie)（通常使(shi)用(yong)胰(yi)蛋白(bai)酶(mei)等(deng)蛋白(bai)水(shui)解(jie)酶(mei)）為單個(ge)細胞(bao)並(bing)進(jin)行(xing)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)（分裂(lie)、傳(chuan)代(dai)或(huo)轉移(yi)）。在1次傳(chuan)代(dai)之(zhi)後(hou)，培(pei)養(yang)物(wu)通常被(bei)稱為細胞(bao)系(xi)。隨(sui)著隨後的每(mei)次(ci)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)，細胞(bao)群(qun)變(bian)得(de)更加(jia)均勻(yun)，因(yin)為生長(chang)更快的細胞(bao)占(zhan)主(zhu)導地(di)位(wei)。也(ye)可(ke)以(yi)通過克隆(long)從(cong)培養(yang)物(wu)中(zhong)選(xuan)出(chu)具(ju)有所(suo)需(xu)特(te)性(xing)的細胞(bao)。

二倍體(ti)細胞(bao)系(xi)很(hen)少會(hui)超過幾次群(qun)體倍增(zeng)。它們(men)的復制能力有(you)限，在 20 到 80 次(ci)種群(qun)倍增(zeng)後開(kai)始(shi)減(jian)慢並(bing)停(ting)止分裂(lie)。

有的證據(ju)表(biao)明(ming)，在細胞(bao)培(pei)養(yang)中觀(guan)察(cha)到的壹些細胞(bao)衰(shuai)老(lao)可(ke)能是由(you)於不(bu)適(shi)當的培養(yang)條件(jian)，而不是預(yu)定(ding)的復制衰(shuai)老(lao)。

還有其他(ta)數(shu)據支(zhi)持某些物(wu)種（尤(you)其是(shi)人類(lei)）的細胞(bao)即(ji)使(shi)在改良的培養(yang)條件(jian)下(xia)生(sheng)長(chang)也(ye)會(hui)出(chu)現(xian)復制性(xing)衰(shuai)老。這種衰(shuai)老(lao)是(shi)由每(mei)次(ci)細胞(bao)分(fen)裂(lie)時(shi)染(ran)色體末(mo)端(duan)（端粒）的縮短(duan)介(jie)導的。

相反(fan)，連續(xu)（或(huo)永(yong)生(sheng)化）細胞(bao)系(xi)具(ju)有無限(xian)的復制能力。這(zhe)些細胞(bao)系(xi)通過多種方式(shi)中的任何(he)壹種通過永(yong)生(sheng)化或(huo)轉化衍(yan)生(sheng)自細胞(bao)系(xi)。許(xu)多連續(xu)細胞(bao)系(xi)來(lai)源(yuan)於(yu)腫瘤組(zu)織(zhi)。 集合中(zhong)的大多數(shu)細胞(bao)系(xi)是(shi)連續(xu)的，盡管(guan)少(shao)數(shu)細胞(bao)系(xi)是(shi)有限的，例如(ru) CCD-1117Sk 人皮膚(fu)成(cheng)纖(xian)維(wei)細胞(bao) (  CRL-2465 ) 或(huo) CCD-18Co 人結腸 (  CRL-1459 )。

 細胞(bao)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)步驟：細胞(bao)的生長(chang)方式(shi)主(zhu)要有(you)兩(liang)種，即(ji)：貼(tie)壁(bi)生長(chang)和懸(xuan)浮生(sheng)長(chang)。當細胞(bao)在單層(ceng)或(huo)懸(xuan)浮液(ye)中生(sheng)長(chang)和分裂(lie)時(shi)，它們(men)通常遵(zun)循(xun)由四(si)個(ge)階段組(zu)成(cheng)的特征性生(sheng)長(chang)模式(shi)：滯(zhi)後(hou)、對數(shu)或(huo)指數(shu)、靜(jing)止或(huo)平穩和下降。

l 停滯(zhi)期(qi)——在培養(yang)培養(yang)瓶接(jie)種後(hou)，細胞(bao)立即緩(huan)慢生(sheng)長(chang)，同時(shi)從傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)的壓力中(zhong)恢(hui)復過來。

l 對數(shu)或(huo)指數(shu)期——細胞(bao)進(jin)入指(zhi)數(shu)生長(chang)期(qi)，壹直(zhi)持(chi)續(xu)到整(zheng)個(ge)生長(chang)表(biao)面被(bei)占據(ju)或(huo)細胞(bao)濃(nong)度(du)超(chao)過培養(yang)基的容(rong)量。

l 靜(jing)止期——細胞(bao)增(zeng)殖減(jian)慢並(bing)停(ting)止。

l 衰退(tui)期(qi)——如(ru)果(guo)不(bu)更換培(pei)養(yang)基且(qie)細胞(bao)數(shu)量不減(jian)少，細胞(bao)就會(hui)失去(qu)活力(li)，數(shu)量也會(hui)減(jian)少。

l 為確(que)保(bao)活力(li)、遺(yi)傳(chuan)穩定(ding)性(xing)和表型穩(wen)定(ding)性(xing)，細胞(bao)系(xi)需(xu)要(yao)維(wei)持(chi)在指數(shu)期。這(zhe)意味(wei)著(zhe)它們(men)需(xu)要(yao)在進入穩(wen)定(ding)生(sheng)長(chang)期(qi)之前(qian)、在單層(ceng)細胞(bao)達到 100% 匯(hui)合之(zhi)前或(huo)在懸(xuan)浮液(ye)達到其最(zui)大推薦細胞(bao)密(mi)度(du)之(zhi)前定(ding)期(qi)進行(xing)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)。為每(mei)個(ge)細胞(bao)系(xi)生(sheng)成生長(chang)曲線(xian)有(you)助(zhu)於確(que)定(ding)細胞(bao)系(xi)的生長(chang)特(te)征。

傳(chuan)代(dai)數(shu)和群體倍增(zeng)水平

原代(dai)培(pei)養(yang)物(wu)通常以(yi) 1:2 的比例傳(chuan)代(dai)（每(mei)次(ci)傳(chuan)代(dai)時(shi)將(jiang)它們(men)分成兩(liang)半(ban)）。大多數(shu)連續(xu)細胞(bao)系(xi)以(yi)更高(gao)的速(su)率復制，並(bing)以(yi)更高(gao)的分流比進(jin)行(xing)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)。傳(chuan)代(dai)數(shu)通常是(shi)細胞(bao)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)到新(xin)容(rong)器中(zhong)的次數(shu)。對於(yu)二倍體(ti)培(pei)養(yang)，傳(chuan)代(dai)數(shu)大致等(deng)於(yu)自(zi)培養(yang)開(kai)始(shi)以(yi)來(lai)的群體倍增(zeng)次數(shu)（或(huo)群體倍增(zeng)水平，PDL）。這不(bu)是(shi)連續(xu)細胞(bao)系(xi)的情況(kuang)，因(yin)為它們(men)以(yi)更高(gao)的分流比傳(chuan)代(dai)。因(yin)此(ci)，PDL 未針對(dui)連續(xu)細胞(bao)系(xi)確(que)定(ding)。在大多數(shu)情況(kuang)下(xia)，PDL 是(shi)壹(yi)個(ge)估計(ji)值(zhi)，因(yin)為它不(bu)考(kao)慮(lv)任何(he)因(yin)壞死或(huo)細胞(bao)雕(diao)亡(wang)死(si)亡(wang)或(huo)接(jie)近(jin)衰老且不(bu)再分裂(lie)的細胞(bao)而丟(diu)失的細胞(bao)。

PDL = 3.32 (log Xe – log Xb) + S

Xb 是孵(fu)育(yu)開(kai)始(shi)時(shi)的細胞(bao)數(shu)。

Xe 是孵(fu)育(yu)時(shi)間(jian)結束時(shi)的細胞(bao)數(shu)。

S 是起始(shi) PDL。

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