從(cong)微生物(wu)和細胞中中分(fen)離(li)線(xian)粒體的基(ji)本步驟方法(fa)

在(zai)人(ren)體內，線(xian)粒體是(shi)我(wo)們(men)身體(ti)的“能量中心(xin)"，它們可以(yi)將營(ying)養(yang)物質(zhi)轉(zhuan)化為ATP等可用能源。除(chu)了(le)在(zai)人(ren)體內外動植(zhi)物(wu)細胞中都(dou)能發現線(xian)粒體存(cun)在。通過(guo)從(cong)微生物(wu)和細胞中分(fen)離(li)出(chu)線(xian)粒體，我(wo)們可(ke)以(yi)更好地了(le)解(jie)其(qi)內在機(ji)制和功能。在本文中，我(wo)們(men)將介(jie)紹從(cong)微生物(wu)和細胞中分(fen)離(li)線(xian)粒體的基(ji)本步驟方法(fa)。

 什(shen)麽是(shi)線(xian)粒體

  自(zi)20世紀初被發現以(yi)來，線(xian)粒體壹直(zhi)被認(ren)為是(shi)細(xi)胞內部的主(zhu)要(yao)能量儲備所在(zai)。線(xian)粒體是(shi)由(you)兩個膜(mo)界限(xian)組(zu)成(cheng)的可(ke)變形的類囊(nang)體(ti)結構，在其(qi)內側(ce)膜中包(bao)含(han)酶群，參與(yu)三(san)磷(lin)酸腺(xian)苷(gan)(ATP)的形成。線(xian)粒體可(ke)進壹步劃(hua)分(fen)為(wei)許(xu)多(duo)結構不同(tong)的亞(ya)種(zhong)，這些(xie)亞(ya)種(zhong)通過(guo)形態和功能上(shang)的區(qu)別(bie)進(jin)行分(fen)類。盡管對線(xian)粒體的研(yan)究(jiu)日趨(qu)深(shen)入，但(dan)分(fen)離(li)線(xian)粒體的技(ji)術(shu)仍然(ran)是(shi)研(yan)究(jiu)員工(gong)常常需要(yao)掌(zhang)握和精(jing)通的技(ji)術(shu)。

從(cong)微生物(wu)中分(fen)離(li)線(xian)粒體的基(ji)本步驟方法(fa)

在微生物(wu)中，將細(xi)胞產物(wu)進(jin)行相(xiang)對簡單地分(fen)離(li)是(shi)較(jiao)為(wei)容易(yi)的。關(guan)鍵(jian)的問(wen)題在(zai)於(yu)如(ru)何(he)有(you)效地純(chun)化(hua)線(xian)粒體並(bing)且(qie)增(zeng)加(jia)其(qi)穩定(ding)性(xing)以(yi)進行更加(jia)深(shen)入的研(yan)究(jiu)。

壹、所需(xu)材(cai)料

l 酵母(mu)培(pei)養(yang)

l 冷凍離心(xin)機(ji)

l 15 毫(hao)升離(li)心管

l 氯(lv)化(hua)鈉 (0.9%)

l 微量移(yi)液器

l 冰(bing)冷(leng)裂(lie)解緩(huan)沖(chong)液

l 搖(yao)床

l 線(xian)粒體儲存(cun)緩(huan)沖(chong)液

l 冰(bing)箱

l 15 ml 微量離心(xin)管

二(er)、從(cong)微生物(wu)（酵母(mu)細(xi)胞）中分(fen)離(li)線(xian)粒體的步(bu)驟方法(fa)：

1. 將過(guo)夜(ye)酵母(mu)培(pei)養(yang)物無菌轉(zhuan)移(yi)到兩個 15ml 離(li)心管(guan)中。

2. 在(zai) 4°C 下(xia)以(yi) 500g 離心(xin) 10 分(fen)鐘(zhong)。

3. 小(xiao)心(xin)去(qu)除(chu)上(shang)清液(ye)，不要(yao)幹(gan)擾沈(chen)澱。

4. 使(shi)用微量移(yi)液器在 1ml 氯(lv)化(hua)鈉 (0.9%) 中小(xiao)心(xin)沖(chong)洗(xi)沈(chen)澱。

5. 使(shi)用微量移(yi)液器丟棄離心管中的氯(lv)化(hua)鈉。

6. 將沈(chen)澱(dian)重懸(xuan)於(yu) 1ml 冰(bing)冷(leng)的裂(lie)解緩(huan)沖(chong)液中，並(bing)使(shi)用微量移(yi)液器充分(fen)混合(he)。

7. 在 4°C 的搖(yao)床上(shang)孵(fu)育 10 分(fen)鐘(zhong)。

8. 在 4°C 下(xia)以(yi) 1000g 離心(xin) 10 分(fen)鐘(zhong)，小(xiao)心(xin)去(qu)除(chu)上(shang)清液(ye)。

9. 將細(xi)胞沈澱(dian)重(zhong)懸於(yu) 1.5 ml 冰(bing)冷(leng)的破(po)碎緩(huan)沖(chong)液中，並(bing)使(shi)用針頭(tou)的鈍(dun)端完成細(xi)胞破碎(sui)。

10. 將裂(lie)解物在(zai) 4°C 下(xia)以(yi) 1000g 離心(xin) 10 分(fen)鐘(zhong)。

11. 將上(shang)清液(ye)轉(zhuan)移(yi)到新鮮(xian)的 15mL 管(guan)中，並(bing)混合(he)從(cong)步驟(zhou) 7 中獲(huo)得的上(shang)清液(ye)。

12. 在 4°C 下(xia)以(yi) 6000g 離心(xin) 10 分(fen)鐘(zhong)並棄去(qu)上(shang)清液(ye)。

13. 用線(xian)粒體儲存(cun)緩(huan)沖(chong)液清(qing)洗顆(ke)粒。

14. 在 4°C 下(xia)以(yi) 6000g 離心(xin) 20 分(fen)鐘(zhong)。

15. 將沈(chen)澱(dian)重懸(xuan)在線(xian)粒體儲存(cun)緩(huan)沖(chong)液中並(bing)儲存(cun)在(zai) -20°C。

三(san)、從(cong)細胞培養(yang)物中分(fen)離(li)線(xian)粒體

1.所(suo)需的生(sheng)物試劑(ji)/實(shi)驗(yan)試劑(ji)

l 1 升(sheng)冷(leng) STE，具有(you)以(yi)下(xia)成分(fen)：

l 250 毫(hao)米蔗(zhe)糖 = 85.58 克(ke)/升(sheng)

l 5 毫(hao)米 Tris = 0.606 克(ke)/升

l 2 毫(hao)米 EGTA = 0.76 克(ke)/升

l 使用 4˚C milliQ實(shi)驗(yan)室純水，pH 值(zhi)至(zhi) 7.4，使(shi)用 2 M HCl，置(zhi)於(yu)冰(bing)上(shang)

2. 從(cong)細胞培養(yang)物中分(fen)離(li)線(xian)粒體的具體方(fang)法(fa)

1. 在 3 x 500 cm2 組(zu)織(zhi)培(pei)養(yang)板中使(shi)細(xi)胞生長(chang)至(zhi) 85-95% 匯合(he)度

2. 在(zai)生(sheng)長(chang)時，吸出(chu)所(suo)有(you)培(pei)養(yang)基。

3. 用 30 ml 冷 STE 清(qing)洗(xi)細(xi)胞單層，吸掉(diao)所(suo)有(you) STE

4. 用 30 ml 冷 STE 清(qing)洗(xi)第(di)二(er)次並吸出(chu)

5. 使(shi)用幹凈(jing)的刀(dao)片從(cong)板表面(mian)刮下(xia)細胞單層

6. 將刮(gua)下(xia)的細(xi)胞重懸(xuan)於(yu) 5 ml 冷(leng) STE 中並(bing)轉(zhuan)移(yi)至離心管(guan) (50 ml) 中。重(zhong)復(fu)兩次。

7. 對所有(you)組(zu)織培養(yang)板重(zhong)復(fu)步驟(zhou) 2-6，將細(xi)胞匯集(ji)到(dao)離心管(guan)中（每(mei) 1 個(ge)托(tuo)盤(pan) 1 個(ge)管）。

8. 在 4˚C 2000 rpm 下(xia)旋轉(zhuan)細胞 10 分(fen)鐘(zhong)。

9. 小(xiao)心(xin)吸出(chu)上(shang)清液(ye)（沈澱(dian)略微擴散(san)）並保(bao)留細胞沈澱(dian)。

10. 在(zai)含有(you)蛋(dan)白酶抑(yi)制劑(ji)和 0.5% 無脂肪(fang)酸 BSA 的 3.5 ml 冷(leng) STE 中重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞沈澱(dian)，轉(zhuan)移(yi)到冷的 7ml 玻(bo)璃-聚四(si)氟(fu)乙(yi)烯(xi)勻漿器中。用 1.5 ml 含 0.5% 無脂肪(fang)酸 BSA 的 STE 洗(xi)滌試管(guan)，然(ran)後轉(zhuan)移(yi)至勻漿器。

11. 通過(guo)“緊密"柱(zhu)塞(sai)緩(huan)慢(man)通過(guo) 10 次使細(xi)胞勻漿，並(bing)將勻漿轉(zhuan)移(yi)到 50 ml 離心管(guan)中。如(ru)果(guo)需(xu)要(yao)，加(jia)滿冰(bing)冷(leng)的 STE。

12. 將勻漿在(zai) 4˚C 下(xia)以(yi) 3000 rpm 的轉(zhuan)速旋轉(zhuan) 3 分(fen)鐘(zhong)（1 管）

13. 通過(guo)雙層濕棉(mian)布過(guo)濾(lv)上(shang)清液(ye)，並在(zai) 4˚C 下(xia)以(yi) 10000 rpm 的轉(zhuan)速旋轉(zhuan) 11 分(fen)鐘(zhong)（2 管）

14. 倒出(chu)上(shang)清液(ye)並擦拭(shi)管內壁(bi)。

15. 在冰(bing)冷(leng)的 STE 中重(zhong)懸(xuan)線(xian)粒體沈(chen)澱，並(bing)轉(zhuan)移(yi)到 15ml 離心管(guan)中。加(jia)入冰(bing)冷(leng)的 STE 並(bing)以(yi) 11,600 G 旋轉(zhuan) 10 分(fen)鐘(zhong)。

16. 使用冷試管(guan)作為杵將線(xian)粒體顆(ke)粒重新懸浮(fu)在殘(can)留的上(shang)清液(ye)中。

17. 將線(xian)粒體放(fang)在冰(bing)上(shang)。

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