hTERT 永(yong)生化(hua)腎上(shang)皮(pi)細(xi)胞培(pei)養(yang)方(fang)法

    血管平滑肌(ji)脂(zhi)肪瘤(liu)是腎臟(zang)的良性腫(zhong)瘤(liu)，起(qi)源(yuan)於假定的血(xue)管(guan)周圍(wei)上皮樣細(xi)胞。這(zhe)些細(xi)胞可(ke)能會分化(hua)成具有黑素細(xi)胞、平(ping)滑肌(ji)或(huo)脂(zhi)肪細(xi)胞特征(zheng)的細(xi)胞。然(ran)而，血(xue)管(guan)平滑肌(ji)脂(zhi)肪瘤(liu)的研(yan)究(jiu)因(yin)缺乏(fa)成熟(shu)的血(xue)管(guan)平滑肌(ji)脂(zhi)肪瘤(liu)衍(yan)生細(xi)胞系(xi)和(he)良好的動(dong)物模型(xing)而受(shou)到限(xian)制。 hTERT 永(yong)生(sheng)化(hua)腎上(shang)皮(pi)細(xi)胞來源(yuan)於血管平滑肌(ji)脂(zhi)肪瘤(liu)，因(yin)此(ci)研(yan)究(jiu)人員(yuan)現在可(ke)以(yi)在體(ti)外利用這(zhe)些細(xi)胞的原(yuan)代(dai)細(xi)胞特性(xing)和(he)延長(chang)的壽(shou)命(ming)。
   UMB1949 細(xi)胞系(xi)  表(biao)達(da) NG2 和(he) L1，並且在塊蛋白(bai) (Tsc2) 的外(wai)顯(xian)子 33 中有壹(yi)個確定的 5bp 缺(que)失，在塊蛋白(bai)（和(he)/或(huo)錯(cuo)構(gou)蛋(dan)白(bai)）中有突變(bian)。因(yin)此(ci)，該細(xi)胞系(xi)可(ke)用於研(yan)究(jiu)結(jie)節性(xing)硬化(hua)癥的信(xin)號(hao)轉(zhuan)導和(he)藥(yao)物效(xiao)率。SV7tert PDGFtu1細(xi)胞系(xi)來源(yuan)於 SV7tert 植入裸鼠引(yin)起的腫(zhong)瘤(liu)。SV7tert 細(xi)胞系(xi)是壹(yi)種(zhong)非致瘤(liu)性(xing)血管平滑肌(ji)脂(zhi)肪瘤(liu)細(xi)胞系(xi)，通(tong)過編(bian)碼(ma) PDGF-BB 的逆轉(zhuan)錄病(bing)毒(du)進(jin)行轉(zhuan)導，使(shi) SV40 大(da) T 抗(kang)原(yuan)和(he)人端(duan)粒(li)酶(mei)永生(sheng)化(hua)。腫(zhong)瘤(liu)來源(yuan)的細(xi)胞分(fen)泌的 PDGF 比(bi)植入前細(xi)胞多(duo) 18 倍(bei)，並(bing)表現出(chu)自(zi)分(fen)泌(mi)轉(zhuan)化(hua)和(he)表觀遺傳變化(hua)。
細(xi)胞培(pei)養(yang)方(fang)案(an)
用單克隆(long)泛(fan)細(xi)胞角(jiao)蛋白(bai)抗(kang)體(ti)（綠(lv)色）和(he) Hoechst 染(ran)料(liao)（藍(lan)色）染(ran)色(se)的 CRL-4004。
所(suo)需材(cai)料(liao)
Dulbecco 改(gai)良 Eagle 培(pei)養(yang)基 (DMEM)
胎(tai)牛(niu)血(xue)清(qing)
Dulbecco 磷(lin)酸鹽(yan)緩沖鹽(yan)水
胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)-EDTA 溶(rong)液(ye)（HBSS 中的 0.25% 胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)/0.53 mM EDTA）
細(xi)胞培(pei)養(yang)測試(shi)的 DMSO
培(pei)養(yang)基
hTERT 永(yong)生(sheng)化(hua)腎上(shang)皮(pi)細(xi)胞可(ke)以(yi)使用加入10%胎(tai)牛(niu)血(xue)清(qing)的DMEM培(pei)養(yang)基進(jin)行培(pei)養(yang)。冷(leng)凍細(xi)胞的處(chu)理程(cheng)序和(he)培(pei)養(yang)的啟(qi)動(dong)
為確保(bao)高水(shui)平(ping)的活(huo)力(li)，解凍小瓶(ping)並在收(shou)到後盡快開(kai)始(shi)培(pei)養(yang)。如(ru)果到達(da)後需要儲存(cun)冷(leng)凍培(pei)養(yang)物，請(qing)將小瓶(ping)儲存(cun)在液(ye)氮(dan)蒸(zheng)氣中，而不(bu)是-70°C。在 -70°C 下儲存(cun)會導致活(huo)性(xing)喪失。
有關(guan)從每批(pi) ATCC 腎上(shang)皮(pi)細(xi)胞中回收(shou)的活(huo)細(xi)胞總(zong)數，請(qing)參(can)閱產(chan)品(pin)信(xin)息表(biao)最(zui)後壹(yi)頁上(shang)提(ti)供的批(pi)次特定(ding)信(xin)息。
1可(ke)以(yi)使用配置好的培(pei)養(yang)基，如(ru)需(xu)在培(pei)養(yang)基中添(tian)加培(pei)養(yang)基添(tian)加劑(ji)需要(yao)註意保(bao)證(zheng)培(pei)養(yang)基的PH保(bao)持(chi)在7.0-7.6之間。註意培(pei)養(yang)基的酸堿度變化(hua)。
2.在 37°C 水浴中輕輕攪拌(ban)解凍小瓶(ping)。為減(jian)少(shao)汙染(ran)的可(ke)能性(xing)，請(qing)將 O 形(xing)圈(quan)和(he)蓋子(zi)遠(yuan)離(li)水。解凍應該(gai)很(hen)快（大(da)約(yue) 2 分(fen)鐘(zhong)）。
3.壹(yi)旦內容物解(jie)凍並通(tong)過浸(jin)入或(huo)噴(pen)灑(sa) 70% 乙醇進行凈化(hua)，立(li)即將小瓶(ping)從水浴中取出(chu)。從這(zhe)壹(yi)點(dian)開(kai)始(shi)的所(suo)有操(cao)作都應(ying)在嚴格的無(wu)菌(jun)條件(jian)下進行。
4.將小瓶(ping)內容物轉(zhuan)移(yi)到含(han)有(you) 9.0 mL 培(pei)養(yang)基的離(li)心管中，並以(yi)大(da)約(yue) 125 xg 的速度將細(xi)胞懸(xuan)浮液(ye)離(li)心 5 至(zhi) 7 分鐘。
5.棄(qi)去(qu)上清(qing)液(ye)，將細(xi)胞稀(xi)釋(shi)後在在細(xi)胞搖瓶(ping)中懸(xuan)浮培(pei)養(yang)。
6.在 37°C、5% CO 2加濕培(pei)養(yang)箱(xiang)中孵育(yu)培(pei)養(yang)物。
細(xi)胞的傳(chuan)代(dai)和(he)維護
註意：
為避(bi)免(mian)結塊(kuai)，在等待細(xi)胞分(fen)離(li)時不(bu)要(yao)通(tong)過敲擊(ji)或(huo)搖動(dong)燒瓶(ping)來攪動(dong)細(xi)胞。置(zhi)於 37°C 以(yi)促進(jin)分(fen)散(san)。
1.通(tong)過每 2 到 3 天更新壹(yi)次培(pei)養(yang)基來維(wei)持(chi)培(pei)養(yang)中的細(xi)胞。
2.有(you)關(guan)細(xi)胞傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)的濃(nong)度，請(qing)參(can)閱產(chan)品(pin)信(xin)息表(biao)。當確(que)定細(xi)胞已(yi)準備(bei)好進(jin)行傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)時，繼續下壹(yi)步(bu)。
3.取出(chu)並丟(diu)棄介(jie)質(zhi)。
4.用 Dulbecco 的磷(lin)酸鹽(yan)緩沖鹽(yan)水沖洗細(xi)胞以(yi)去除血清(qing)痕跡(ji)。
5.向(xiang)燒瓶(ping)中加入 2.0 至(zhi) 3.0 mL 胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)-EDTA 溶(rong)液(ye)，在倒(dao)置(zhi)顯(xian)微鏡下觀察(cha)細(xi)胞，直(zhi)至(zhi)細(xi)胞層(ceng)分(fen)散(san)（通(tong)常(chang)在 5 至(zhi) 10 分鐘內(nei)）。
6.添(tian)加 6.0 至(zhi) 8.0 mL 的生(sheng)長(chang)培(pei)養(yang)基，並(bing)通(tong)過輕輕移(yi)液(ye)吸出(chu)細(xi)胞。
7.將細(xi)胞懸(xuan)浮液(ye)轉(zhuan)移(yi)到 15 mL 離(li)心管中，並以(yi)大(da)約(yue) 125 xg 的速度旋(xuan)轉(zhuan) 5 至(zhi) 10 分鐘。
細(xi)胞的維(wei)護
1.丟(diu)棄上(shang)清(qing)液(ye)並(bing)在新鮮(xian)生長(chang)培(pei)養(yang)基中重懸(xuan)細(xi)胞。將適當(dang)的細(xi)胞懸(xuan)浮液(ye)等(deng)分(fen)試(shi)樣(yang)添(tian)加到新的培(pei)養(yang)容器(qi)中。有關(guan)推薦的接(jie)種(zhong)濃度，請(qing)參(can)閱產(chan)品(pin)表(biao)。
2.在 37°C、5% CO 2加濕培(pei)養(yang)箱(xiang)中孵育(yu)培(pei)養(yang)物。
細(xi)胞凍存(cun)時的註意事項
可(ke)以(yi)使用已(yi)補發(fa)細(xi)胞凍存(cun)液(ye)，也可(ke)以(yi)使用95% 培(pei)養(yang)基+5% DMSO進(jin)行細(xi)胞凍存(cun)。避(bi)免(mian)直接(jie)將細(xi)胞浸(jin)入液(ye)氮(dan)液(ye)相中。

  蘇(su)州阿(e)爾法生(sheng)物提(ti)供(gong)的IPSC細(xi)胞、誘導分化(hua)幹細(xi)胞、骨(gu)髓(sui)幹細(xi)胞、幹(gan)細(xi)胞誘導分化(hua)培(pei)養(yang)基等(deng)廣(guang)泛(fan)應用於類(lei)器(qi)官生成，組織形(xing)成等(deng)領域(yu)。