細(xi)胞支原體汙染怎(zen)麽處(chu)理

  用肉眼或光(guang)學(xue)顯(xian)微(wei)鏡檢測支原體比較(jiao)困難，所以支(zhi)原體檢測壹(yi)般會(hui)通過(guo)PCR 的(de)檢測、DNA 染色、熒光標記(ji)、瓊脂(zhi)平板接種等 方法(fa)來(lai)實(shi)現(xian)。在支(zhi)原體檢測之前(qian)，細胞應連續培養(yang)至少兩周，以便(bian)有時間讓低水(shui)平的汙(wu)染(ran)物(wu)生長。對(dui)於測試，在取(qu)樣前(qian)至少兩三天(tian)內不應更(geng)換(huan)培養(yang)基(ji)。

壹(yi)、培養(yang)法(fa)

在(zai)瓊脂(zhi)平板/肉湯(tang)上培養(yang)被認(ren)為是檢測支原體的“金標準(zhun)"。在這種方法(fa)中(zhong)，將(jiang)細胞培養(yang)物(wu)的(de)上(shang)清液(ye)添(tian)加(jia)到(dao)液(ye)體(ti)或半(ban)固(gu)體培養(yang)基(ji)（含有支原體生長所(suo)必(bi)需(xu)的(de)營養(yang)物(wu)質(zhi)）中(zhong)。受(shou)感染(ran)的(de)細(xi)胞培養(yang)物(wu)會(hui)在(zai)液(ye)體(ti)肉湯(tang)和瓊脂(zhi)平板上(shang)生長。瓊脂(zhi)平板上(shang)很容(rong)易(yi)看到(dao)支原體菌落。這種方法(fa)能(neng)夠(gou)檢測大多(duo)數(shu)支原體種類(lei)，除(chu)了(le)少數(shu)種類(lei)。

二(er)、PCR法(fa)

另(ling)壹(yi)種用於檢測支原體的方法(fa)是使(shi)用(yong) PCR。在該(gai)技(ji)術(shu)中，使用(yong)了(le)對(dui)各(ge)種常(chang)見感染(ran)性(xing)支(zhi)原體的 16s RNA 基因(yin)特異的 PCR 引物(wu)。範圍廣(guang)泛的引(yin)物(wu)涵(han)蓋(gai)了(le)幾乎(hu)所有的(de)感染(ran)性(xing)支(zhi)原體。該(gai)過(guo)程(cheng)中使(shi)用的(de)引(yin)物(wu)是物(wu)種/基因(yin)特異性或通用(yong)的。這種方法(fa)快(kuai)速(su)、高效、可靠且具(ju)有(you)成(cheng)本效益(yi)。

基於傳(chuan)感器(qi)細(xi)胞的方(fang)法(fa)使(shi)用(yong)專門(men)的細(xi)胞來(lai)檢測培養(yang)物(wu)中(zhong)支(zhi)原體的存在。壹(yi)旦這些細胞檢測到(dao)支原體，它們就(jiu)會引(yin)發壹(yi)系列(lie)化(hua)學(xue)反(fan)應，從(cong)而(er)引起(qi)明(ming)顯(xian)的(de)顏(yan)色變(bian)化(hua)。該(gai)方法(fa)靈(ling)敏度(du)高但特(te)異性低(Degeling, 2012)。

三、使用支(zhi)原體檢測試劑盒(he)

生物(wu)發光檢測試劑盒(he)可從(cong)不同的生物(wu)技(ji)術(shu)公(gong)司獲得，這些試劑盒(he)是基(ji)於酶(mei)的支(zhi)原體檢測試劑盒(he)。這些試劑盒(he)可檢測不是由(you)真核細胞合(he)成(cheng)的支(zhi)原體酶(mei)。首(shou)先(xian)，試劑盒(he)成(cheng)分會(hui)破(po)壞(huai)支(zhi)原體，然後(hou)使用特(te)定的(de)酶(mei)來(lai)觸(chu)發產(chan)生發光的細胞機制。然後(hou)可以通過(guo)光(guang)度(du)計檢測到(dao)這壹(yi)點。

可以在(zai)受(shou)感染(ran)的(de)培養(yang)基(ji)中(zhong)加(jia)入非(fei)特異性 DNA 染料來(lai)檢測支原體。當在熒光顯(xian)微(wei)鏡下(xia)觀察(cha)時，支原體 DNA 以小(xiao)簇的形式出(chu)現，與(yu)細胞 DNA 分開(kai)。

四、熒光染色法(fa)

熒光 DNA 染色是另(ling)壹(yi)種 DNA 染色方(fang)法(fa)。此(ci)方法(fa)使(shi)用(yong) DAPI 和 Hoechst 33258 等 DNA 染料對(dui)所(suo)有 DNA 進行(xing)染(ran)色。在(zai)此(ci)過(guo)程(cheng)中需(xu)要(yao)壹(yi)些專業知識(shi)，因(yin)為結(jie)果解(jie)釋可能很困難。支原體的低密度(du)、其(qi)他(ta)細(xi)菌(jun)的(de)汙(wu)染或這些細菌產(chan)生的(de)細胞外熒光信(xin)號會(hui)阻(zu)礙正確的(de)結果解(jie)釋。此(ci)外，來(lai)自(zi)核區域(yu)的(de)信(xin)號使(shi)支原體的檢測變得(de)困(kun)難。

有關更(geng)多(duo)支(zhi)原體檢測試劑盒(he)，實(shi)驗室儀器(qi)設(she)備相(xiang)關內(nei)容(rong)，請進入蘇(su)州阿爾(er)法(fa) 生物(wu)實(shi)驗器材(cai) 有(you)限(xian)公(gong)司網站(zhan)進行(xing)了(le)解(jie)。

預(yu)防(fang)支(zhi)原體汙染的(de)方(fang)法(fa)

1. 加(jia)強實驗室操作(zuo)管理(li)：嚴格(ge)控(kong)制實驗室操作(zuo)，加(jia)強實驗服(fu)的消毒除菌，要求(qiu)實(shi)驗室工(gong)作(zuo)人(ren)員(yuan)戴(dai)口罩(zhao)和手套(tao)，保證實驗室的清(qing)潔(jie)。

比如(ru)通過(guo)培訓(xun)合(he)格(ge)的細(xi)胞培養(yang)人(ren)員(yuan)，從(cong)而(er)消除不規範操作(zuo)所引(yin)起(qi)的(de)支(zhi)原體汙染。如(ru)果可能，應提供(gong)壹(yi)個(ge)單獨(du)的(de)實(shi)驗室用於細(xi)胞培養(yang)和細胞系的(de)維(wei)護(hu)。為(wei)實(shi)驗室設施提供(gong)這樣的環境(jing)不僅可以減少支(zhi)原體，還(hai)可以避免其(qi)他(ta)細(xi)菌(jun)和真菌汙(wu)染。

另(ling)外要(yao)做(zuo)好(hao)細(xi)胞室的消毒工(gong)作(zuo)，熟練掌握(wo)季銨酸(suan)鹽(yan)消毒液(ye)、醇(chun)類(lei)消毒液(ye)、殺(sha)孢子(zi)劑等消毒劑的(de)使(shi)用(yong)方法(fa)，同(tong)時(shi)做(zuo)好(hao)個(ge)人(ren)防(fang)護(hu)工(gong)作(zuo)，比如(ru)：工(gong)作(zuo)時戴(dai)上手套(tao)，使用後(hou)丟棄(qi)。確保(bao)定期更(geng)換(huan)手套(tao)和口罩(zhao)，而(er)不是將(jiang)它們放在(zai)實(shi)驗室外套(tao)的口袋(dai)裏。

為(wei)實驗室配備單獨(du)的(de)鞋子(zi)，以避免帶(dai)入細(xi)菌和環境(jing)汙(wu)染物(wu)。

還(hai)有(you)需(xu)要(yao)註意(yi)的是人(ren)類(lei)口(kou)腔(qiang)中(zhong)其(qi)實(shi)也含有多(duo)種支原體，當妳說(shuo)話(hua)、大笑(xiao)、打噴(pen)嚏(ti)或(huo)咳(ke)嗽時(shi)，支(zhi)原體也可能會進入細(xi)胞培養(yang)物(wu)。所(suo)以細(xi)胞室內盡量避免在實驗室內打(da)噴(pen)嚏(ti)或(huo)咳(ke)嗽或(huo)大(da)聲說話(hua)。

2. 更換(huan)汙染(ran)的(de)細胞源：更換(huan)汙染(ran)的(de)細胞源，以確保(bao)細胞的正常(chang)生長和發育(yu)。

被汙染(ran)的細(xi)胞源是支(zhi)原體汙染擴(kuo)散(san)的(de)主(zhu)要(yao)途(tu)徑之壹(yi)。所以，已被汙染(ran)的細(xi)胞可以直接丟棄(qi)，避免造成(cheng)交叉(cha)汙染，除(chu)非(fei)價格(ge)較(jiao)高或典(dian)型(xing)樣品(pin)。

3. 采用有(you)效的(de)消毒措施：采用有(you)效的(de)消毒措施，如(ru)紫(zi)外(wai)線(xian)消毒、甲醛消毒等，有效殺(sha)滅細胞汙染(ran)源。

    4.細胞傳代(dai)培養(yang)前(qian)要做(zuo)好(hao)支(zhi)原體汙染檢查

A.細(xi)胞使用(yong)前(qian)也需(xu)要(yao)檢查細(xi)胞系儲備液(ye)是否存在支(zhi)原體汙染。

B.確保(bao)用於傳(chuan)代培養(yang)的(de)血清中(zhong)不存在汙(wu)染。避免使用過(guo)期(qi)產(chan)品(pin)或(huo)存放時(shi)間較(jiao)長的(de)試劑。

C.盡可能使用(yong)新(xin)鮮(xian)的培養(yang)基(ji)和密封緊(jin)密的培養(yang)基(ji)。

D.使(shi)用(yong)壹(yi)次(ci)性移液(ye)器(qi)以避免交叉汙(wu)染(ran)。

E.確保(bao)在工(gong)作(zuo)之前(qian)和期間將所有必(bi)需(xu)的(de)設備和試劑放在(zai)層(ceng)流氣流中。

F.在使(shi)用細(xi)胞系進行(xing)檢測或分(fen)析(xi)之前(qian)，對(dui)支(zhi)原體汙染進行(xing)常(chang)規檢查。

G.可以選(xuan)擇使(shi)用(yong) 0.1 微(wei)米過(guo)濾器(qi)進行(xing)過(guo)濾除(chu)菌(jun)，可以減少支(zhi)原體汙染的(de)發生。

H.避免細胞培養(yang)物(wu)長時(shi)間暴露(lu)在(zai)空(kong)氣中，並確保(bao)在將它們放入培養(yang)箱(xiang)之前(qian)擰(ning)緊瓶(ping)蓋(gai)。以防(fang)止(zhi)氣溶(rong)膠汙染(ran)。盡量以小(xiao)瓶(ping)的(de)形式對(dui)冷(leng)凍保存的細(xi)胞系進行(xing)備份(fen)，即使(shi)冷(leng)凍保存細胞的活(huo)力隨著(zhe)每(mei)次(ci)傳代培養(yang)而(er)降(jiang)低。

5.實驗室設備與(yu)支原體汙染

定(ding)期(qi)熏蒸層流和實驗室設施也可以有(you)效(xiao)降(jiang)低支原體汙染的(de)發生概率(lv)。

用(yong)於細(xi)胞培養(yang)的(de)CO 2培養(yang)箱(xiang)不得過(guo)度(du)擁(yong)擠(ji)（填(tian)充(chong)不超過(guo)其(qi)容(rong)量(liang)的 60%），否則會導(dao)致(zhi)支原體從(cong)壹(yi)種細胞系感染(ran)到(dao)另(ling)壹(yi)種細胞系。

多(duo)個(ge)細(xi)胞系不應儲存在壹(yi)個(ge)培養(yang)箱(xiang)中(zhong)，因(yin)為它會增(zeng)加(jia)交(jiao)叉汙(wu)染(ran)的(de)風(feng)險(xian)。

應定(ding)期清(qing)潔(jie) CO2 培養(yang)箱(xiang)，避免任何形式的潮(chao)濕。為保持(chi)濕度(du)而(er)提供(gong)的(de)蒸餾水(shui)應定(ding)期更(geng)換(huan)，因(yin)為支(zhi)原體、細菌和真菌可以駐留(liu)在這些容(rong)器(qi)中。

水(shui)浴鍋(guo)、液(ye)氮(dan)容(rong)器(qi)、試劑瓶(ping)等感染(ran)源必(bi)須(xu)定期清(qing)洗，定(ding)期檢查有(you)無(wu)汙染(ran)。

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支原體汙染的(de)處(chu)理辦法(fa)：

那(na)麽妳發現了(le)支(zhi)原體汙染，妳(ni)接下來(lai)要(yao)做(zuo)什麽？直接的方(fang)法(fa)是丟(diu)棄(qi)受(shou)感染(ran)的(de)細(xi)胞培養(yang)瓶(ping)。在(zai)樣本不可替代或(huo)非(fei)常(chang)昂貴(gui)的(de)情(qing)況下(xia)，只(zhi)能(neng)采取(qu)壹(yi)些方(fang)法(fa)進行(xing)支(zhi)原體清除來(lai)彌補(bu)損(sun)失(shi)。

支(zhi)原體清除是壹(yi)個(ge)非(fei)常(chang)耗時的過(guo)程(cheng)，並且(qie)會增(zeng)加(jia)對(dui)其(qi)他(ta)健(jian)康(kang)細(xi)胞系造(zao)成(cheng)二次(ci)汙染的風(feng)險(xian)。根(gen)據感染(ran)的(de)嚴重程(cheng)度(du)，支(zhi)原體清除可能需(xu)要(yao)幾周(zhou)到(dao)幾個(ge)月(yue)的(de)時(shi)間。 支必(bi)清(qing)是壹(yi)種使用廣泛支原體清除試劑，可以清(qing)除(chu)培養(yang)基(ji)中(zhong)存在的(de)大部分(fen)支(zhi)原體。此(ci)外，BM Cyclin、氟喹(kui)諾(nuo)酮(tong)環丙(bing)沙(sha)星、ciprobay、zagam、baytril、四(si)環(huan)素等藥物(wu)也(ye)可用於從(cong)受(shou)感染(ran)培養(yang)物(wu)中(zhong)去(qu)除(chu)支原體。

支必(bi)清(qing)可以有(you)效(xiao)去(qu)除(chu)大部分(fen)支(zhi)原體汙染，使(shi)用(yong)方(fang)便(bian)，對(dui)廣(guang)泛的支(zhi)原體有效。雖然這些方法(fa)不能保證(zheng)去(qu)除(chu)支原體，但可以去(qu)除(chu)大部分(fen)支(zhi)原體汙染。總的來(lai)說(shuo)，在(zai)進行(xing)支(zhi)原體清除時(shi)，是會(hui)影(ying)響到(dao)細胞的生長和細胞活(huo)力的。

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