貼壁(bi)細胞傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)的(de)基本步驟(zhou)

  我們(men)知(zhi)道開(kai)始(shi)培(pei)養(yang)的(de)細(xi)胞不(bu)能無(wu)限(xian)期地(di)生長(chang)，因為受(shou)限(xian)區域(yu)內(nei)的(de)細(xi)胞數量(liang)不(bu)斷增加(jia)，營養物(wu)質也(ye)會被(bei)消耗(hao)，從(cong)而 導致有(you)毒(du)的(de)代(dai)謝產物(wu)增加(jia)，另(ling)外(wai)根(gen)據(ju)實(shi)驗(yan)或生(sheng)產需要，也要(yao)對細(xi)胞進行 擴(kuo)大(da)培養(yang)。通(tong)過去除(chu)培(pei)養基並(bing)將(jiang)細(xi)胞轉移(yi)到(dao)新(xin)鮮的(de)生(sheng)長(chang)培養基和基質(zhi)中，細(xi)胞獲(huo)得了(le)新(xin)鮮的(de)營養並(bing)去除(chu)了(le)有(you)毒代謝物，從(cong)而可以長期維持(chi)培(pei)養(yang)。這(zhe)個(ge)過程(cheng)就(jiu)屬(shu)於傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)，傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)的(de) 細(xi)胞 密(mi)度(du)會低於原(yuan)始(shi)培(pei)養(yang)物(wu)中的(de)細(xi)胞密(mi)度(du)。當接(jie)種(zhong)細(xi)胞後(hou)， 細胞生長會經(jing)過滯後(hou)期、對數期(qi)，穩定期(qi) 和雕(diao)亡(wang)期。在(zai)雕亡(wang)期，細(xi)胞會因缺乏營養或培(pei)養條(tiao)件(jian)不(bu)當而死亡(wang)。貼壁(bi)細胞傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)步驟(zhou)如下：
壹、細胞檢查(zha)
  細胞解凍(dong)後(hou)需要進行細(xi)胞狀態(tai)檢(jian)查(zha)，確(que)保細胞生長狀態(tai)正(zheng)常，確(que)保無(wu)細(xi)菌(jun)汙染(ran)、無(wu)支(zhi)原(yuan)體(ti)汙染(ran)。培養(yang)貼壁(bi)細胞時(shi)，主要貼壁(bi)於培(pei)養(yang)皿(min)或燒(shao)瓶(ping)底部，培(pei)養基呈(cheng)粉(fen)橙(cheng)色。由於培(pei)養(yang)基中(zhong)細胞（或汙染(ran)）的(de)代(dai)謝產物(wu)酸化，pH 指示(shi)劑(ji)酚紅變黃(huang)。MDCK 細(xi)胞在(zai)對數生(sheng)長期呈(cheng)多(duo)邊形，單(dan)層生長(chang)。使用(yong)正(zheng)常的(de)明(ming)場照明(ming)很難看(kan)到(dao)它們(men)。通(tong)過切換到相襯(chen)，可以更(geng)容(rong)易(yi)地(di)識(shi)別(bie)細(xi)胞。
記錄(lu)細(xi)胞狀態(tai)對於確(que)保實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)壹致非(fei)常(chang)重(zhong)要(yao)。通(tong)過活(huo)細(xi)胞成(cheng)像儀(yi)可以通(tong)過遠程(cheng)控(kong)制輕松成(cheng)像和保存。研(yan)究(jiu)人員(yuan)可以拍(pai)攝(she)細(xi)胞圖像以跟蹤培(pei)養狀(zhuang)態(tai)並(bing)將(jiang)圖(tu)像(xiang)傳(chuan)輸(shu)到智(zhi)能設備或 U 盤。


二、細(xi)胞收獲(huo)
1.將(jiang)培(pei)養(yang)基從(cong)細(xi)胞中吸出到廢(fei)物(wu)容(rong)器(qi)中。也(ye)可以使用(yong)連接(jie)到瑞寧的(de)真(zhen)空(kong)吸(xi)液(ye)器(qi)。
2.用(yong) 5 ml 不(bu)含(han) Ca 和 Mg 的(de)預熱 PBS 小心(xin)洗滌(di)細(xi)胞最(zui)多(duo) 3 次，以去除殘留培(pei)養(yang)基中(zhong)的(de)胎(tai)牛血(xue)清 (FBS)。FBS 或 FBS 替代(dai)品(pin)會抑(yi)制(zhi)胰蛋白(bai)酶(mei)。加(jia)入(ru) 3 ml 含(han)EDTA的(de)胰蛋白(bai)酶(mei)並(bing)輕(qing)輕晃(huang)動(dong)覆(fu)蓋(gai)貼壁(bi)的(de)細(xi)胞並在(zai) 37°C的(de)水(shui)浴鍋中(zhong)孵(fu)育並解離細胞。 不(bu)同的(de)細(xi)胞系需要不(bu)同的(de)胰蛋白(bai)酶(mei)孵(fu)育時(shi)間(jian)。為(wei)避免過度(du)胰蛋白(bai)酶(mei)消化會損壞(huai)細胞，請每(mei)隔幾分鐘在(zai)顯微(wei)鏡(jing)下檢(jian)查(zha)壹次。
3.輕輕沖洗板並(bing)將(jiang)細(xi)胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)轉移(yi)到(dao) 50 ml 試管(guan)中(zhong)，並(bing)以 800 rpm 的(de)速(su)度(du)向下旋(xuan)轉 5 分(fen)鐘(zhong)
分(fen)離(li)的(de)細(xi)胞應呈(cheng)圓(yuan)形並在(zai)胰蛋白(bai)酶(mei)溶液(ye)中自(zi)由漂(piao)浮(fu)。壹旦細(xi)胞分離，向培養(yang)皿(min)中加(jia)入(ru) 5 ml 培養基以使胰蛋白(bai)酶(mei)失活(huo)。
4. 分(fen)離(li)的(de)細(xi)胞應該(gai)是(shi)圓(yuan)形的(de)並(bing)且(qie)在(zai)胰蛋白(bai)酶(mei)溶液(ye)中自(zi)由漂(piao)浮(fu)。
三(san)、細(xi)胞計(ji)數
1. 由(you)於臺(tai)盼藍可(ke)以選擇性地(di)穿透(tou)死(si)細(xi)胞的(de)細(xi)胞膜(mo)將(jiang)死(si)細(xi)胞染(ran)成(cheng)藍色，所以使用(yong)臺(tai)盼藍溶液(ye)染(ran)色有利(li)於觀(guan)察(cha)細(xi)胞的(de)活(huo)力。根(gen)據(ju)這(zhe)壹特點(dian)我們(men)將(jiang)100UL細(xi)胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)與(yu)100UL的(de) 0.4% 的(de)臺(tai)盼藍溶液(ye)混合(he)均(jun)勻(yun)後(hou)，再(zai)進行細(xi)胞觀察。
2.將(jiang)移(yi)液(ye)器(qi)吸頭(tou)放在(zai)蓋(gai)玻(bo)片(pian)邊緣並(bing)輕輕(qing)排(pai)出細胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)，從(cong)而將(jiang)細(xi)胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)裝入(ru)計(ji)數室(shi)（每(mei)個計(ji)數區(qu)約(yue) 4 µl）。蓋(gai)玻(bo)片(pian)下的(de)區(qu)域(yu)通(tong)過毛細(xi)管(guan)作(zuo)用(yong)填(tian)充。
3.將(jiang)細(xi)胞計(ji)數板放在(zai)細胞計(ji)數儀(yi)中進行細(xi)胞計(ji)數。

四(si)、稀(xi)釋(shi)
1.將(jiang)所(suo)需體積的(de)細(xi)胞（適當數量(liang)的(de)細(xi)胞）以所需的(de)分(fen)流(liu)比（此處(chu)為(wei) 1:10）吸取(qu)到(dao)新(xin)培(pei)養(yang)皿(min)中，然(ran)後(hou)用(yong)培(pei)養(yang)基將(jiang)其加(jia)滿(man)至(zhi)每(mei)個培養皿(min)中所(suo)需的(de)體(ti)積(ji)（10 毫(hao)升(sheng)）。註意(yi)培養皿(min)蓋(gai)上(shang)的(de)細(xi)胞類型、細(xi)胞分裂(lie)日期(qi)和傳(chuan)代(dai)數。將(jiang)細(xi)胞放回(hui) 37°C 的(de)培(pei)養(yang)箱中。
2.以所需的(de)分(fen)流(liu)比將(jiang)所(suo)需體積的(de)細(xi)胞（適當數量(liang)的(de)細(xi)胞）移入(ru)新(xin)培(pei)養(yang)皿(min)中。
讓(rang)細(xi)胞過夜以恢(hui)復(fu)和沈(chen)澱(dian)。24 小時(shi)後(hou)，用(yong)顯(xian)微(wei)鏡(jing)檢查(zha)細胞的(de)形(xing)狀(zhuang)、粘附和是(shi)否存在(zai)汙染(ran)。
3.細胞應該(gai)附著(zhe)在(zai)培養(yang)皿(min)底部並(bing)且已經(jing)開始(shi)生(sheng)長(chang)和分(fen)裂(lie)。更(geng)換培養(yang)基以去除任何(he)殘(can)留的(de)解離劑或細(xi)胞碎片。培養細(xi)胞直(zhi)到(dao)它們(men)融(rong)合(he)並準備好(hao)進行實(shi)驗(yan)或下(xia)壹次傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)。
4.細胞應當附著在(zai)培養(yang)皿(min)底部並(bing)開始(shi)生(sheng)長(chang)和分(fen)裂(lie)。
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