動(dong)物(wu)細(xi)胞(bao)培養生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)中乳酸含(han)量(liang)的控(kong)制(zhi)方(fang)法(fa)

銨產量(liang)過(guo)多(duo)、乳(ru)酸產量(liang)過剩(sheng)、營養(yang)限(xian)制(zhi)或(huo)與營養(yang)補(bu)給(gei)、添(tian)加(jia)堿(jian)以控(kong)制(zhi) pH 值(zhi)相關(guan)的高(gao)滲應激等(deng)因(yin)素，使(shi)得動物(wu)細(xi)胞(bao)培養生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)中的細(xi)胞(bao)密度被(bei)限(xian)制(zhi)。

為(wei)了(le)部(bu)分(fen)克服(fu)這(zhe)些因(yin)素，使(shi)用乳(ru)酸補充(chong)和適應LSA 技(ji)術(shu)是減(jian)少(shao)銨和乳酸產生(sheng)的壹(yi)種(zhong)簡(jian)單方(fang)法(fa)。使(shi)用這(zhe)種簡(jian)單的方(fang)法(fa)，可(ke)以實(shi)現(xian)了(le)將(jiang)近(jin)乳(ru)酸產量(liang)的大幅(fu)度減(jian)少(shao)，同時在(zai)分(fen)批搖(yao)瓶(ping)培養中減(jian)少(shao)了(le) 50% 的銨產量(liang)。在(zai)隨後(hou)的補(bu)料(liao)分(fen)批生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)培養中，使用Biosen C-Line 乳(ru)酸分(fen)析儀(yi)測(ce)定乳(ru)酸產量(liang)減(jian)少(shao)了(le)近(jin)8八(ba)倍。甚(shen)至(zhi)可(ke)以實(shi)現(xian) 3500 萬(wan)個細(xi)胞(bao)/mL 的活(huo)細(xi)胞(bao)密度和 2.73 億個細胞(bao)-天/mL 的完(wan)整活細胞(bao)天數(shu)。

減(jian)少(shao)乳酸和銨鹽(yan)產量(liang)的方(fang)法(fa)總(zong)結(jie)

在(zai)動物(wu)細(xi)胞(bao)培養領(ling)域(yu)，許(xu)多(duo)研(yan)究(jiu)人員觀(guan)察(cha)到(dao)乳(ru)酸和銨積累(lei)會嚴重(zhong)影響(xiang)到(dao) 細胞(bao)的生(sheng)長。 60多(duo)年(nian)來(lai)，科(ke)學(xue)家已開發(fa)出(chu)多(duo)種(zhong)方(fang)法(fa)來(lai)減(jian)少(shao)乳酸 和銨的產(chan)生(sheng)。

 常(chang)用方(fang)法(fa)匯(hui)總見(jian)表(biao)

        大約在(zai)過去 35 年(nian)裏(li)，隨(sui)著(zhe)生(sheng)物(wu)制(zhi)藥(yao)行(xing)業(ye)生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)動(dong)物(wu)細(xi)胞(bao)培養從(cong)低密度分(fen)批培養轉(zhuan)向(xiang)高(gao)密度補料(liao)分(fen)批培養，乳(ru)酸和銨積累(lei)方(fang)面 的挑(tiao)戰大幅(fu)增加(jia)。減(jian)少(shao)乳酸積累(lei)制造(zao)創(chuang)新藥(yao)物(wu)的基(ji)本(ben)要求(qiu)是：

(1)在(zai)所有與工業(ye)相關(guan)的細(xi)胞(bao)系和工藝(yi)生(sheng)產(chan)過(guo)程(cheng)中，將乳(ru)酸和銨的產(chan)量(liang)降低到足(zu)夠低的水(shui)平，以免對細胞(bao)生(sheng)長和產品質(zhi)量產(chan)生(sheng)負面影響(xiang)，

(2)在(zai)根(gen)據當(dang)前良好(hao)生(sheng)產(chan)規範 (cGMP) 運(yun)行(xing)的大規模工業(ye)生(sheng)產(chan)中。

  為(wei)減(jian)少(shao)乳酸積累(lei)曾經(jing)嘗試(shi)過(guo)用替(ti)代糖(tang)替代(dai)葡(pu)萄(tao)糖(tang)，當時(shi)，人(ren)們並(bing)未廣(guang)泛(fan)認識到銨積累(lei)可(ke)能是壹個(ge)問題，因(yin)此未報(bao)告(gao)有關(guan)銨水平的數(shu)據(NR)。事(shi)實上(shang)，許(xu)多(duo)早(zao)期這(zhe)樣(yang)的方(fang)法(fa)以及(ji)許(xu)多(duo)目(mu)前的方(fang)法(fa)都(dou)減(jian)少(shao)了(le)乳(ru)酸的產(chan)生(sheng)，但(dan)增加(jia)了(le)銨的產(chan)生(sheng)。當(dang)測(ce)試(shi)用於補料(liao)分(fen)批培養時(shi)，替代(dai)糖(tang)（例如(ru)半(ban)乳(ru)糖(tang)）有時會導(dao)致(zhi)與葡(pu)萄(tao)糖(tang)類似(si)的生(sheng)長。

   相對低水平的銨，通常(chang)在(zai) 2到10 mM 之(zhi)間，可(ke)能對細胞(bao)生(sheng)長和生(sheng)產(chan)力(li)以及(ji)糖(tang)基化(hua)產(chan)生(sheng)負面影響(xiang)，甚(shen)至(zhi)可(ke)能對某(mou)些重組(zu)糖(tang)蛋白(bai)的生(sheng)物(wu)活(huo)性、穩定(ding)性(xing)和/或免疫原性(xing)產生(sheng)負面影響(xiang)。銨是動物(wu)細(xi)胞(bao)培養中重要的抑(yi)制(zhi)性代謝(xie)物(wu)之(zhi)壹。銨的負面影響(xiang)通(tong)常(chang)在(zai)比乳酸（例如(ru) 20–40 mM）低(di)大約十(shi)倍（例(li)如(ru) 2–4 mM）的濃度下實(shi)現(xian) 。因(yin)此，以氨的少(shao)量(liang)增加(jia)為(wei)代價(jia)來減(jian)少(shao)乳酸當然是不(bu)可(ke)取(qu)的。

        將(jiang)培養基(ji)中的葡(pu)萄(tao)糖(tang)控制(zhi)在(zai)低水平——以限(xian)制(zhi)葡(pu)萄(tao)糖(tang)對細胞(bao)的供(gong)應——已被(bei)用於減(jian)少(shao)乳酸產生(sheng)超(chao)過(guo)三(san)十(shi)年(nian)。這(zhe)可(ke)以通(tong)過(guo)多(duo)種(zhong)方(fang)式實現，例如(ru)直(zhi)接測(ce)量和自(zi)動(dong)或(huo)手(shou)動反(fan)饋(kui)控制葡(pu)萄(tao)糖(tang)水平。當(dang)葡(pu)萄(tao)糖(tang)而(er)非谷氨酰胺(an)被(bei)控(kong)制(zhi)在(zai)低水平時(shi)，通常(chang)會發(fa)生(sheng)葡(pu)萄(tao)糖(tang)攝取(qu)和乳酸生(sheng)成(cheng)的理(li)想(xiang)減(jian)少(shao)，但這(zhe)通常(chang)與谷氨酰胺(an)攝取(qu)和銨生(sheng)成(cheng)的不(bu)良增加(jia)密切(qie)相關(guan). 因(yin)此，為(wei)了(le)盡量減(jian)少(shao)乳酸和銨的產(chan)生(sheng)，可(ke)能需(xu)要同時控(kong)制葡(pu)萄(tao)糖(tang)和谷氨酰胺(an)。

 關(guan)於生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)細(xi)胞(bao)培養過(guo)程(cheng)中的葡(pu)萄(tao)糖(tang)乳酸含(han)量(liang)的測(ce)定可(ke)以使(shi)用Biosen C-Line 乳(ru)酸分(fen)析儀(yi)，該儀(yi)器(qi)使用外(wai)部傳(chuan)感器(qi)系統(tong)對葡(pu)萄(tao)糖(tang)和乳酸水平進(jin)行(xing)樣(yang)品測(ce)試(shi)，根(gen)據反(fan)應(ying)罐(guan)內的養(yang)分(fen)消耗(hao)和細胞(bao)代謝(xie)狀(zhuang)態(tai)來(lai)適當進(jin)行(xing)補(bu)料(liao)。

 目(mu)前，許(xu)多(duo)研(yan)究(jiu)人員還(hai)嘗試(shi)開發(fa)代(dai)謝(xie)工程(cheng)方(fang)法(fa)來(lai)減(jian)少(shao)乳酸或銨的產(chan)生(sheng)。總(zong)的來(lai)說(shuo)，事(shi)實證明(ming)，通(tong)過基因(yin)工程(cheng)改(gai)善代(dai)謝(xie)表(biao)型比 1980 年(nian)代(dai)最初(chu)設想(xiang)的要困難得多(duo)。所(suo)以，除了(le) GS 方(fang)法(fa)之(zhi)外(wai)，迄今(jin)為(wei)止(zhi)，還沒(mei)有其他減(jian)少(shao)乳酸 或氨產(chan)量(liang)的代(dai)謝(xie)工程(cheng)方(fang)法(fa)在(zai)工業(ye)中得到廣(guang)泛(fan)采用。

其實(shi)，當(dang)前有四種(zhong)簡(jian)單而(er)常(chang)用的減(jian)少(shao)乳酸和銨產量(liang)的方(fang)法(fa)：

(1) 降低培養溫度

(2) 降低培養 pH

         (3) 向(xiang)培養基(ji)補充(chong)銅(tong)

         (4) 選擇(ze)具有乳酸消耗(hao) (LC) 表(biao)型的克(ke)隆。

         盡管(guan)所(suo)有這(zhe)些方(fang)法(fa)都(dou)被(bei)普遍(bian)采用，但(dan)需要註意的是，這(zhe)些方(fang)法(fa)均(jun)不(bu)能普遍(bian)減(jian)少(shao)乳酸和氨的產(chan)生(sheng)。溫度和 pH 變化通常(chang)根(gen)據具體情(qing)況進(jin)行(xing)優(you)化(hua)，可(ke)能對細胞(bao)生(sheng)長和/或產品質(zhi)量 產(chan)生(sheng)負面 或正面 影響(xiang)。雖然 pH 值(zhi)下降通常(chang)會減(jian)少(shao)乳酸產量(liang) ， 但它也(ye)會導(dao)致(zhi)谷氨酰胺(an) 消耗(hao)和銨產量(liang)增加(jia) 。銅(tong)補充(chong)劑是壹種(zhong)簡(jian)單的方(fang)法(fa)，但(dan)不(bu)會減(jian)少(shao)所有相關(guan)細(xi)胞(bao)系的乳(ru)酸產量(liang)，並(bing)且(qie)還(hai)會對產品質(zhi)量產(chan)生(sheng)積(ji)極(ji)或(huo)消極(ji)的影響(xiang)。 選(xuan)擇具有乳酸消耗(hao) (LC) 表(biao)型的克(ke)隆本(ben)質(zhi)上並(bing)不(bu)普遍(bian)，因(yin)為(wei)它需(xu)要具有特(te)定生(sheng)產(chan)力(li)、產(chan)品質(zhi)量或(huo)其他潛(qian)力(li)的克(ke)隆可(ke)能會由(you)於缺(que)乏(fa) LC 表(biao)型而(er)被(bei)丟(diu)棄(qi)。對於某(mou)些克隆，LC 表(biao)型可(ke)能由(you)於未知(zhi)因(yin)素偶(ou)爾會丟(diu)失，即(ji)使在(zai)經(jing)過(guo)驗(yan)證的 cGMP 工藝(yi)生(sheng)產(chan)商(shang)業(ye)產品中也(ye)是如(ru)此。

   LSA 技術(shu) 減(jian)少(shao)工業(ye)細胞(bao)培養中乳酸和銨產量(liang)

     近(jin)年(nian)來(lai)，壹(yi)種(zhong)減(jian)少(shao)生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)動(dong)物(wu)細(xi)胞(bao)培養中乳酸和銨產量(liang)的新(xin)方(fang)法(fa)被(bei)提(ti)出(chu)。這(zhe)種方(fang)法(fa)就(jiu)是LSA 技術(shu)，它主要采用乳(ru)酸補充(chong)培養基(ji)等(deng)方(fang)式來實現。使用該(gai)技術(shu)，補料(liao)分(fen)批培養物(wu)可(ke)生(sheng)長至(zhi)每(mei)毫(hao)升(sheng) 3500 萬(wan)個細(xi)胞(bao)的活(huo)細(xi)胞(bao)密度。這(zhe)個數(shu)據遠高(gao)於行(xing)業(ye)所公布(bu) 的每(mei)毫(hao)升(sheng)5-45 百(bai)萬(wan)個細(xi)胞(bao)的值(zhi)。同樣(yang)，實現(xian)的每(mei)毫(hao)升(sheng) 2.73 億個細胞(bao)日的 IVCD 值(zhi)也(ye)與行(xing)業(ye)所公布(bu)的每(mei)毫(hao)升(sheng)30-2.75 億個細胞(bao)日的值(zhi)相當(dang)。

LSA 技術(shu)作為(wei)壹項(xiang)新興(xing)起(qi)的技(ji)術(shu)在(zai)細胞(bao)培養行(xing)業(ye)尤(you)其是大規模細胞(bao)培養行(xing)業(ye)、生(sheng)物(wu)制(zhi)藥(yao)行(xing)業(ye)發(fa)揮著(zhe)重(zhong)要作用。

     蘇州阿爾法(fa)提(ti)供(gong)的EKF Biosen C-Line 乳(ru)酸分(fen)析儀(yi)可(ke)用於生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)動(dong)物(wu)細(xi)胞(bao)培養過(guo)程(cheng)中生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)內(nei)的葡(pu)萄(tao)糖(tang)、乳酸測(ce)定，同時支(zhi)持定制(zhi)各(ge)種(zhong)規格的生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)、生(sheng)物(wu)發(fa)酵(jiao)罐(guan)等(deng)，更(geng)多(duo)實(shi)驗(yan)室(shi)儀器設備(bei)需求(qiu)可(ke)進(jin)入蘇州阿爾法(fa)生(sheng)物(wu)實(shi)驗(yan)器(qi)材網(wang)站(zhan)進(jin)行(xing)了(le)解。